致猪水肿病大肠杆菌stx2e基因缺失株的构建及其相关功能性分析

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1、学位论文致猪水肿病大肠杆菌Stx2e基因缺失株的构建及其相关功能性分析TheconstructionoftheStx2egenedeletionmutantsfromSLTECcausingporcineedemadiseaseandsomerelatedfunctionanalysis研究生：张志强导师：朱国强教授扬州大学畜禽病原微生物研究室2012年6,EJ张志强：致猪水肿病大肠杆菌Stx2e基因缺失突变株的构建及删㈣㈣㈣iiiiiiiii舢iiY2258121一致猪水肿病大肠杆菌Stx2e基因缺失株的构建及其相关功能性分析专业：预防兽医学研究生：张志强导师：朱国强

2、教授中文摘要猪水肿病是常发于断奶后仔猪的一种具有致命性的肠毒血症，其病原为某些特定血清型的产志贺样毒素大肠杆菌，一经发病，病死率极高，给全球养猪业带来重大经济损失。研究发现，直接引发猪水肿病发生的元凶是致病大肠杆菌产生的一种蛋白类毒素Stx2e。致病菌通过F18ab菌毛粘附猪肠上皮细胞后，产生并释放Stx2e毒素，通过肠壁吸收入血，造成特定组织损伤，从而导致水肿病的发生。由于病原血清型复杂，灭活疫苗的预防效果并不理想。除此之外，某些致猪水肿病大肠杆菌并不产生单一脓2P毒素，亦可产生其他的肠毒素(最常见的是STa、STb)，也给本病的预防带来较大困难。经检测，致猪水肿病大

3、肠杆菌1522标准株以及1525株不含有除Stx2e毒素基因以外的其他常见毒素基因，故此本研究选取该菌作为研究对象，成功构建Stx2e毒素基因缺失株，为进一步深入研究Stx2e毒素与机体相互作用的分子机制，水肿病致病机理及对国内猪大肠杆菌病的防控策略奠定了一定基础。久,-Red同源重组系统被广泛的应用于某些革兰氏阴性菌基因组的特定基因的修饰，是对基因进行功能分析的有效手段。该方法可以对目的基因的任何位点进行插入、删除或者是用外源DNA序列进行替换，而并不涉及到使用限制性内切酶、DNA连接酶，大大的简化了操作。本实验中应用该系统修饰和缺失大肠杆菌目的基因的过程可简述如下：

4、基于Stx2e基因的已知序列，首先将能够编码Red同源重组酶的辅助质粒转化至野生株中，制备感受态细胞。设计合成一对5’端与Stx2e基因同源，3’端与氯霉素抗性基因同源的引物扩增氯霉素抗性基因，然后将纯化的产物转化野生型大肠杆菌，该细胞中已提前导入含有诱导型启动子的质粒pKD46，利用该质粒编码的入噬菌体的Red同源重组系统构建其基因缺失突变株，筛选阳性菌株，并将pCP20质粒导入重组菌，利用其编码的Flp重组酶消除氯霉素标记，得到所要的Stx2e基因缺失株，并通过PCR检验和测序手段加以验证。Vero细胞毒性实验进一步在细胞水平证明了Stx2e毒素基因的缺失。在152

5、2AStx2e成功构建的基础上，比较分析了野生株和突变株相关生物学特性的变扬州人学硕士学位论文化。体外生长实验和酵解实验表明，同样的培养条件下，1522AStx2e株生长速度及生长周期各个阶段的特性与野生株相比没有差异，其分解发酵糖类和氨基酸的能力也未发生改变。但是细菌粘附实验表明，相较野生株，Stx2e基因缺失株细菌粘附猪肠上皮细胞IPEC—J2的能力大幅度降低，可达30％。最后，我们将K99菌毛基因通过pMDl8一T载体克隆／k,1522／kStx2e中，并通过玻板凝集试验证明了该重组菌能够同时表达K99和自身的F18菌毛基因，细胞粘附实验表明了该重组株粘附IPEC

6、—J2细胞能力相较野生株增强了近一倍。关键词：大肠杆菌1522，F18菌毛，Red重组系统，Stx2P基因，突变株张志强：致猪水肿病大肠杆菌Stx2e基因缺失突变株的构建及其相关功能性分析TheconstructionoftheStx2egenedeletionmutantsfromSLTECcausingporcineedemadiseaseandsomerelatedfunctionanalysisM．D．Candidate：ZhangZhiqiangSupervisor：Prof．ZhuGuoqiangAbstractPorcineedemadisease(ED)

7、isafrequentlyfatalenterotoxaemiathatusuallyOCCURSinpostweaningpigletswhenvariousnutritionalandenvironmentalfactorspredisposethemtothedisease，andtheoutbreaksofEDusuallybringsgreateconomiclosstoswineindustry．Thediseaseisattributedtoaheat-labiletoxincalledShigatoxin2e(Stx2e)