致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌cya、crp双基因缺失突变株的构建及其相关功能性分析

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1、工锴：致鹅卵黄性腹膜炎火肠杆菌cya、crp双基因缺失突变株的构建及其功能性分析致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌cya、crp双基因缺失突变株的构建及其相关功能性分析专业：预防兽医学研究生：王锴导师：朱国强教授中文摘要鹅卵黄性腹膜炎(俗称蛋子瘟)，多发于产蛋高峰期的种鹅群，该病死亡率较高并且可导致种蛋受精率和出雏率下降，它是家禽重要的细菌性传染病，病原为禽致病性大肠杆菌(AvianpathogenicEscherichiacoli，APEC)，且易与其它病原性细菌、病毒并发或混合感染，本病已严重影响到养鹅业的发展。由于APEC血清型众多，目前尚无商品化疫苗使用，并且伴随细菌耐药性问题的日趋严重，该病

2、的药物控制越来越受到严格限制。如何致弱APEC病原菌，获取免疫原性能好、低或无毒性的活菌疫苗以有效抵抗APEC病原菌的感染己成为养鹅业迫在眉睫的问题。随着研究的深入，发现某些管家基因的缺失会引起细菌毒力的减弱，例如cya(adenylatecyclase)、crp(cAMPreceptorprotein)基因。这两个基因分别是编码合成cAMP的腺苷酸环化酶以及编码cAMP的受体蛋白CRP。cAMP与CRP是菌体转运和降解营养物质过程中的调控因子，cAMP受体蛋白CRP也是目前已知的大肠杆菌7个总调控蛋白中最为重要的一个，它调控了约50％的转录单位的起始。鉴于cya、crp基因的重要作用，其与

3、致病因子的关系必然成为近来研究的一个热点。已有报道国外学者已在鼠伤寒沙门氏菌和APEC病原菌02，078血清型中成功构建cya、crp双基因缺失株，并在动物体内证实缺失株毒力的致弱，且保留了良好的免疫原性。本实验基于cya，crp基因的已知序列，利用九噬菌体Red重组系统对致鹅卵扬州人学硕士学位论文黄性腹膜炎大肠杆菌优势血清型国内分离株G8107(血清型02：K89)、G803(血清型039：K89)、G8102(血清型未定)，和大肠杆菌J5(脂多糖突变株)的cya、crp基因进行敲除，构建AcyaAcrp双突变株。其主要构建步骤为：首先PCR扩增出两翼与cya基因上下游序列同源，中间为氯霉

4、素抗性基因的DNA片段，然后转化入G8107、G803、G8102和J5，在Red重组系统表达重组酶的帮助下，含氯霉素抗性基因的PCR产物通过其两侧的cya基因同源序列与禽大肠杆菌染色体上的cya基因发生同源重组，通过氯霉素抗性平板筛选得到阳性克隆，对筛选得到的阳性克隆再导入编码Flp重组酶的质粒pCP20，通过第二次重组去除抗性基因，结合PCR扩增和测序鉴定，从而证明Aeya突变株G8107Acya、G803Acya、G8102Acya、J5Acya构建正确。在成功构建Acya突变株的基础上用相同的方法继续构建AcyaAcrp双基因突变株。在成功构建单突变株Acya与双突变株AcyaAcr

5、p缺失株的基础上，比较分析了野生株和单突变株以及双突变株在糖酵解、生长速度、毒力致弱方面的生物学特性。突变株体外酵解试验表明，与野生株不同，其不能正常利用乳糖、麦芽糖、蔗糖；生长速度试验表明突变株明显低于野生株，这是由于细菌缺少在转运和降解营养物质过程中发挥调节作用的cya、crp基因，从侧面证实cya、crp基因的正确缺失。通过一日龄气管环接种雏鸡构建动物模型，检测突变株毒力试验，结果表明6日内最高剂量组(3xlogcFu)中野生株、Acya突变株，AcyaAcrp双突变株的死亡率分别为60％、20％、O％，实验结果表明了双突变株毒力较大程度的减弱。本实验利用Red重组系统，成功构建了致鹅

6、卵黄性腹膜炎大肠杆菌国内优势血清型分离株G8107、G8102、G803的Acya、AcyaAcrp突变株，并且证实了缺失株毒力的致弱。基因缺失减毒株的成功构建，为进一步深入研究禽致病性大肠杆菌管家基因cya，crp与其致病力相互作用的关系提供了一种新的方法，以及为研制禽致病性大肠杆菌活菌弱毒苗奠定基础。关键词：禽致病性大肠杆菌；入Red重组系统；cya、crp突变；生物学特性工锴：致鹅卵黄性腹膜炎火肠杆菌cya、crp双基因缺失突变株的构建及其功能性分析TheconstructionofthecyacrpdeletionmutantsfromAPECthatcausesgooseyolkp

7、eritonitisandsomerelatedfunctionanalysisM．D．Candidate：WangKaiSupervisor：Prof．ZhuGouqiangAbstractGooseyolkperitonitis，causedbyavianpathogenicEscherichiacoli(APEC)，isoneofthecommonestdiseasesforavianinfectiou