禽病原性大肠杆菌e058株和尿道致病性大肠杆菌u17株neuc、prop基因突变株的构建及其致病性评价

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1、禽病原性大肠杆菌E058株和尿道致病性大肠杆菌U17株刃2祝C、prop基因突变株的构建及其致病性评价ConstructionofneuC、proPmutantsofavianpathogenicEScherlchiCfcolistrainE058、uropathogenicEscherichiacoliU17andevaluationoftheirpathogenicity研究生：徐亚亚专业：预防兽医学导师：高崧教授刘秀梵教授扬州大学兽医学院2012年5月中文摘要禽病原性大肠杆菌E058株和尿道致病

2、性大肠杆菌U17株neuC、proP基因突变株的构建及其致病性评价摘要研究生：徐亚亚导师：高崧教授刘秀梵教授禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avianpathogenicEscherichiacoli，APEC)弓I起的一种常见的局部或全身性感染的细菌性传染病，且易与其它病原性细菌、病毒并发或混合感染。目前，该病己成为危害养禽业的重要细菌病，给养禽业带来严重威胁和造成重大经济损失。尿道感染(urinarytractinfections，UTIs)在人类疾病中是比较常见的，大部分妇女都会经历一次尿道感

3、染。迄今，尿道致病性大肠杆菌(uropathogenicEscherichiacoli，UPEC)是尿道感染中最常见的病原体。UPEC通过自身所带的毒力因子黏附并侵入宿主，突破宿主的防御系统，引起组织的损伤。UPEC在肠道外的生长能力使得它们能引起尿道感染在内的各种疾病。基于APEC和UPEC的致病潜能，APEC和UPEC被归为新型致病性大肠杆菌一肠道外病原性大肠杆菌(extraintestinalpathogenicEscherichiacoli，ExPEC)。由于APEC和UPEC在肠道外感染中可

4、能会面临宿主相似的挑战，它们可能具有某些相似的致病基因和致病能力。很多研究证明，APEC和UPEC的毒力因子之间存在着一定的相似性。我们之前的研究利用DNA芯片分别对APECE058株和UPECU17株在鸡体内和体外的转录子进行了分析，结果显示neuC基因呈显著上调趋势，同时我们通过选择性捕获转录序列方法得出proP基因可能跟致病性相关。因此，本研究中选择构建neuC和proP这两个基因的突变株并评价其与致病性之间的关系。运用Red重组系统构建E058AneuC、U17AneuC、E058AproP、

5、U17AproP基因缺失突变株。Southernblot结果显示Kanamycin和Zeocin抗性基因在E058AneuC、U17AneuC和E058AproP、U17AproP质粒中的插入是单拷贝的；RT-PCR结果表明E058AneuC和U17AneuC的neuC基因不能转录，E058AproP和U17AproP的proP基因不能转录，而相关基因的上下游基因的转录并未受影响。在血清杀菌实验中，与野生株E058和U17相比，E058AneuC和U17AneuC在血清中的存活率下降(P

6、而E058AproP和U17AproP与中文摘要野生株相似。巨噬细胞HDll的吞噬结果显示，与野生株E058和U17相比，E058AneuC和U17AneuC突变株的吞噬率显著升高，而E058AproP和U17AproP突变株的吞噬率跟野生株相当。体内竞争结果表明，在35日龄的SPF鸡体内，与野生株E058、U17相比，突变株E058AneuC和U17AneuC竞争性生长能力显著下降(P

7、8和U17相比没有差异。体内动态分布实验中，E058AneuC和U17AneuC突变株在受检脏器中的细菌数较APECE058株和UPECU17株均明显下降，其中在心、肝、脾、肾中下降特别明显(P<0．0001)，在肺中下降也很明显(P<0．001)，而E058AproP和U17AproP突变株在受检脏器中的细菌数与APECE058株和UPECU17株类似。上述结果显示，neuC基因与APECE058株和UPECU17株的致病性有较强关联，而proP基因与APECE058株和UPECU17株的致病性无关

8、。关键词：禽病原性大肠杆菌；尿道致病性大肠杆菌；突变株；致病性AbstractConstructionofneuC、propmutantsofavianpathogenicEscherichiacolistrainE058、uropathogenicEscherichiacoliU17andevaluationoftheirpathogenicityAbstractM．S．candidate：XuYayaAdvisor：Prof．GaoSongProf．