禽病原性大肠杆菌neuC基因突变株的构建和突变株中λRed系统引入抗性的去除及其致病性的研究.pdf

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1、禽病原性大肠杆菌neuC基因突变株的构建和突变株中入Red系统引入抗性的去除及其致病性的研究ConstructionofneuCmutantofavianpathogenicEscherichiacoliandthedeletionofchlormycetinresistancegeneintroducedby九Redsystemfromthemutantandevaluationoftheirpathogenicity本文受国家自然科学基金(31272559、30471281)资助研究生：王丹丹专业：预防兽医学导师：高崧教授扬州大学兽医学院2014年6月中文摘要禽病原性大肠杆菌neuC基

2、因突变株的构建和突变株中；LRed系统引入抗性的去除及其致病性的研究摘要研究生：王丹丹导师：高崧教授ⅢIIJIllllllflllllllJIIIll／llJIIIllIJilllJlllJY2632137禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avianpathogenicEscherichiacoli，APEC)弓I起的一种常见的局部或全身性感染的细菌性传染病，包括大肠杆菌性肉芽肿、腹膜炎、输卵管炎、脐炎、滑膜炎、气囊炎、眼炎、卵黄性腹膜炎等疾病，随着集约化养禽业的发展，给养禽业带来严重的经济损失。荚膜多糖是禽致病性大肠杆菌的重要的致病因子，能够保护机体免受宿主免疫系统的侵害，neuC是荚膜

3、多糖区域二的基因，neuC基因的缺失会使荚膜在合成方面产生缺陷。本研究利用L-Red同源重组的方法构建了E058AneuC：：cat、E058AneuC基因缺失突变株，同时将带有相应启动子的neuC全基因和完整的“意外转录本’’插入表达载体pGEX．6P．1中，构建相应的回复株。PCR扩增出带有酶切位点的neuC基因并将其插入到pMD@19．Tsimplevector载体中，筛选出阳性重组子pMD—T-neuC，然后运用分子克隆方法将chlormycetin(cat)抗性基因插入到目的基因neuC中，构建出带有chlormycetin抗性基因质粒pMD．neuC-Cat。PCR扩增neuC

4、-Cat，并电转入带有pKD46的禽病原性大肠杆菌分离株E058中，运用同源重组的方法，筛选出基因突变株E058AneuC：：cat，然后将质粒pCP20电转入突变株E058AneuC：：cat，去除chlormycetin抗性，筛选出无抗性突变株E058AneuC。体外生长曲线的测定表明，突变株E058AneuC：：cat、E058AneuC的生长速度与亲本株相似，差异不明显。RT-PCR结果表明，在有抗性突变株E058AneuC：：cat中，基因的缺失只影响该基因本身的表达，其上下游基因转录正常，而在去抗性突变株E058AneuC中，在上下游基因正常转录的情况下，我们发现去抗性后残余的

5、片段竟然出现了转录，我们称之为“意外转录本”neuCIo12日龄SPF鸡胚的致死率试验中，亲本株E058的死亡率为90％，有抗性突变株E058AneuC：：cat的死亡率为83．3％，无抗性突变株E058AneuC的死亡率86．7％，表明突变株较之亲本株毒力有一定的下降。1日龄SPF鸡致死试验结果说明，突变株较之野生株致病性高度致弱，无抗性突变株E058AneuC与有抗性突变株E058AneuC：：cat相比致病性相对提高了。SPF鸡血清杀菌试验结果表明，突变株较之野生中文摘要II一株毒力高度致弱；HD．11细胞吞噬试验表明，E058AneuC：：cat与野生株相比抗吞噬能力高度致弱，但E

6、058AneuC较之野生株差异不显著；在35日龄SPF鸡体内，与野生株E058相比，不管是有抗突变株E058AneuC：：cat，还是无抗突变株E058AneuC，其在鸡体内的定居与持续实验均被高度致弱(P

7、其致病性恢复到E058AneuC水平，上述结果显示，有抗性突变株E058AneuC：：cat去除抗性后致病性放大的原因可能与意外转录子相关联，其致病性放大的分子机制还有待进一步研究。关键词：禽致病性大肠杆菌，L-Red同源重组，突变株，意外转录子，致病性AbstractConstructionofneuCmutantofavianpathogenicEscherichiacoliandthedeletionofchlor