禽病原性大肠杆菌肠菌素相关基因ente、ents、tolc突变株的构建及其致病性评价

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2、，２２５００９廣＇■－．－—／—梦／申请学位级别：直主：一学科专业名称通蛙＾－Ｓ方策＇么论文提交日期；２０１５年６月论文答辩日换学位授予单位：扬州大学学位授予曰期；２０１５年６月答辩委员会主席：了伊＇－．’节‘、－Ｋ方？＾产，乂乂．鱗＞修择靖書讀；０＾自：識争鹏６月道資絶务言謁禽病原性大肠杆菌肠菌素相关基因化、£？巧、化把突变株的构建及其致病性评价Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ

3、ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ’ｅｎｅｓ《。祀《巧化／Ｃｍｕｔａｎｔｓｏｆａｖｉａｎａｔｈｏｅｎｉｃ热ｃ＆ｅｒｚｃ片ｇ，成ｐｇｃｏｌｉ研究生：高如霞专业：预防兽医学导师；高接教授扬州大学兽医学院２０１５年６月Ａ化Ｃ肠ｇ访Ｃ基因突Ｉ島如霞：菌素相关基因ｅ加、ｅｎ、化／变株的构建及其致病性评价禽病原性大肠杆园肠国素相关基因ｅｗ巧、ｅｎ巧、化／Ｃ关变株的构建及其致病性评价摘要禽致病性大肠杆菌（ＡＰＥＣ）属于肠道外致病性大肠杆菌（ＥｘＰＥＣ）的成员，能通过呼吸道和生殖道

4、等多种途径感染并引起禽类各种肠道外疾病。目前，该病己成为危害养禽业的重要细菌病之一，给养禽业造成了重大经济损失，尤其是那些养禽业发达的国家，例如，己西、中国、美国。对于大肠杆菌来说铁离子是一种必需成分，但动物体内游离的铁离子浓度很低，不能满足细菌的生存要求，因此大肠杆菌进化出多种摄铁机制从宿主体内竞争铁离子，肠菌素铁摄取系统就是其中一种。铁离子对于大肠杆菌在宿主体内生存和发挥毒力起着关键作用，这使得铁摄取系统如铁结合性复合物能够成为发展新型药物的靴位点。本研充旨在研究肠菌素相关基因６？化、

5、议、ｔｏ／Ｃ与ＡＰＥＣ致病性之间的关系，为揭示ＡＰＥＣ的致病机一步构建Ａ理及进ＰＥＣ弱毒疫苗株奠定基础。运用ＩＲｅｄ重组系统构建Ｅ０５８ＡｅＷ怎、Ｅ０５８ＡｅｗＳ、臥５８Ａ／ｏ／Ｃ、Ｅ０５８Ａｅｎ化Ａｅ内议、Ｅ０５８Ａｅｎ／￡Ａｅｎ沾Ａｔｏ／Ｃ基因缺失突变株化／Ｃ基因完整阅读框插，同时将带有相应启动子的入低拷贝载体ＰＡＣＹＣ－ｅ打化１８４中，通过电转化突变株来筛选获得回复株。ＲＴＰＣ艮结果表明和化／Ｃ基因均不能转录，而其上下游基因的转录不受影响。１日龄ＳＰＦ鸡致死性试验结果表明，与野生株相比，

6、Ｅ０５８Ａ化／Ｃ及Ｅ０５８Ａｅｗ化Ａｃｔ沾心ｏ／Ｃ突变株的致病力显著降低，而Ｅ０５８Ａｅｎ化、Ｅ０５８ＡｅＭ议、Ｅ０５８Ａｅｎ化Ａｅｎ议突变株致弱不明显。３５日龄ＳＰＦ鸡体内定居与持续试验结果表明，Ｅ０５８Ａ化／Ｃ和Ｅ０５８Ａｅｎ化Ａｅｎ沾Ａ妃／Ｃ突变株在各脏器的定居与持续能力均显著低于野生株Ｅ０５８（Ｐ＜０．０００１），同时，Ｅ０５８Ａｅｎ化Ａｅｗ议Ａｔｏ／Ｃ突变株较Ｅ０５８Ａｔｏ／Ｃ突变株的定居与持续能力显著降低。生长曲线的测定结果显示，，在ＬＢ培养基中，各突变株生长速度与野生株相似并未表

7、现出明显差异，但在贫铁培养基中，Ｅ０５８Ａｅｎ祀Ａｅｎ沾Ａ扣／ＣＨ基因突变株的生长速度显著低于野生株，而其它突变株生长速度较野生株均没有表现出显著差异。血清杀菌试验思示各突变株和野生株没有表现出显著差异。体外竞争试验结果显示，在ＬＢ培养基中，除Ｅ０５８Ａｅｎ沾外，突变株均表现为轻度致弱ｅｎ：，而在贫铁培养基中，王基因突变株Ｅ０５８Ａ化Ａｅｎ议Ａ化化表现ｎ扬州大学硕±学位论文－Ｅ０Ａ化为中度致弱。ＨＤ１１细胞吞隆试验结果显示，与突变株５８／Ｃ相比，突变株－显著Ｅ０５８Ａｅｎ化Ａｅｗ议

8、Ａｔｏ／Ｃ对ＨＤ１１细胞侵袭率明虽增加，差异。这些结果表明，参与肠菌素外膜输出基因化於与ＡＰＥＣＥ０５８菌株的致病性高度相关，而参与肠菌素合成基因ｅｎ化和内膜运输基因ｅｗ访不影响ＡＰＥＣ的致病性。并且Ｓ基因缺失株Ｅ０５８ＡＣＷ丘Ａｅｎ议Ａｆｏ／Ｃ的生长速度在贫铁条件下受到抑制，巧鸡的感染模型中，送种生长方面的缺陷或许会在体内有