质粒转染的原理.doc

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1、质粒转染的原理(2011-10-2212:32:05)转载▼标签：转染科研教育分类：细胞/动物转染DEAE-葡聚糖（Diethylaminoethyl(DEAE)-dextran）：这个早在1965年出现的转染方法差不多是最古董级的方法之一了，直到现在竟然还有少数人坚持采用。带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的DNA分子，使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克，也可能是细胞内吞作用，使得DNA复合体进入细胞。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染，可重复性好，转染时要除掉血清。磷酸钙共

2、沉淀转染：最早是在1973年开始采用的。氯化钙＋DNA＋磷酸缓冲液按一定的比例混合，形成的极微小的磷酸钙-DNA复合物沉淀粘附到细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要，pH值，钙离子浓度，DNA浓度，沉淀反应时间，细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响，重复性不佳。现在还会操作这种古董级方法的人怕已经不多啦。比起DEAE法这个更容易得到稳定转染，但是转原代细胞比较困难的。电穿孔法：通过短暂的高场强电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。DNA被认为是穿过孔扩散到细胞

3、内。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。理论上说电穿孔法可用于各种细胞，而且不需要另外采购特殊试剂。可是需要昂贵的设备——这个一次性投资可不便宜，而且每次转染需要更多的细胞和DNA——因为细胞死亡率高，所以每种细胞电转的条件都需要优化，才能达到最佳效果。现在，由于电转染技术的革新以及新型电转染仪的面世，电穿孔法的应用也越来越普遍。脂质体：中性脂质(lipid)是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电阳离子脂质体(Cationicliposomes)则不同

4、，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，据认为一个约5kb的质粒会结合2-4个阳离子脂质体，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入培养的细胞。脂质体转染方法始于1987年，这个方法的出现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高，并广为使用。阳离子脂质体细胞毒性相对较高，对不同的细胞可能会干扰细胞的代谢。血清的存在有可能会影响转染效率，需要进行优化。通常转染试剂有不同脂质（lipid）和脂质体（liposome）混合配方。非脂质体的脂质（Non-liposomall

5、ipids）：这个读着颇为拗口的新一代技术，代表着脂质体技术的未来发展方向——革新配方成分形成胶束（micellar）结构而非简单的双层膜结构，令核酸传递更有效率而且细胞毒性也显著降低活化的树状聚合物（Activateddendrimers）：这个确乎是Qiagen的独门配方的Activateddendrimers本来真正属于纳米技术，高度树状分枝形成球形结构有着均一的大小和形状，借助每个球体无数活化的氨基末端凝聚在DNA上形成较为致密的结构，并吸附在细胞膜上，经过内吞进入细胞。活化的氨基可以调节胞内融酶体的pH值，抑制降解活性，使得DNA稳定

6、存在。转染的效率高，毒性低，可重复性好。血清的存在能显著提高转染效率。多胺和新一代转染介质：多胺其实也是氨基多聚物，原理无非基于吸附带负电的核酸形成非共价结合的复合物，结合并穿越同样带负电的细胞膜。优点是可以携带较大的分子，而且细胞毒性也较低，不会干扰细胞代谢途径。新一代转染介质并不局限于单一成分，各种不同专利配方的脂质、加上蛋白质组分、以及各种各样的专利成分，务求令转染效率更高，操作更方便，细胞毒性更低。还有的产品将脂质偶联到细胞膜特定受体蛋白的配基上，让受体蛋白更有效率地转运DNA或者生物大分子复合物进入细胞......显微注射和基因枪（B

7、iolisticparticledelivery）：显微注射和基因枪是更特殊的导入DNA的方式：将DNA沉淀包被在极为微小的金颗粒（闪闪发光的金珠，goldbeads）上，借助高压基因枪将大分子直接“射”入细胞，一旦细胞接受，就会发生瞬时表达——这种方法多用于活体内导入DNA，比如皮肤的DNA免疫。也有用于上皮细胞原代细胞的报告。最新技术是利用硅纳米颗粒作为基因转染载体。显微注射顾名思义就是使用一根超细针头将DNA，RNA或蛋白直接注入细胞质或细胞核；整合的机会高一些，但适用这种方法的细胞好像不多，体外受精较为常见。这两种方法需要的昂贵设备和相

8、对复杂的技术，令普通实验室敬而远之。病毒介导的感染：荷马史诗对整个欧美文化的影响内在而深远的。受荷马史诗中的特洛依木马的启发，借助病毒高效感染细胞的机