质粒电穿孔转染条件的选择

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1、万方数据第38卷第6期第858页2009年12月华中科技大学学报(医学版)ActaMedUnivSciTechnolHuazhongV01．38No．6P．858Dec．2009，+。+。+。+。+、i技术交流i＼．．⋯．．．．．／．质粒电穿孔转染条件的选择*杨薇1。王迪-。陈克清1于敏1王桂华2胡俊波2△王晶1△1华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系。武汉4300302华中科技大学同济医学院附属同济医院分子医学中一O，武汉430030关键词电穿孔转染；质粒中图法分类号R331DOI：10．3870／j．issn．1672-0741．2009．06．037电穿孑L转

2、染，作为物理方法的一种，出现于20世纪80年代中期[1]。这种方法不仅能够将DNA、RNA，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。它是一种高效、简便的基因转移系统，具有其它转移方法无可比拟的优越性，如操作简便、快捷，可重复性强，臻染率高，’适用谱广等。尤其对目前一般认为难转染的悬浮培养细胞[2]，亦能获得较高的转染率。本文将简述电穿孔转染方法的基本原理和过程，并从电参数、细胞因素、质粒因素、温度、缓冲液以及培养液成分等方面介绍质粒电穿孑L转染条件的研究进展。1电穿孔转染的基本原理及过程电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后，在细胞膜

3、上暂时形成小孔或开口，把大分子如DNA等导入细胞并最终进入胞核的技术。其过程简述如下：首先在电击过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触，并与细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。再次电击后，质粒脱离复合物并扩散至胞质内，开始瞬转；同时小部分质粒进入核内与染色体整合，开始稳转。一旦DNA扩散进入细胞，细胞膜上的小孔可自动重新闭合Is-4]。2电穿孔转染条件的选择2．1电参数电场强度E与电压V有以下关系：V—E×d，’国家自然科学基金资助项目(No．30872472)杨薇，女，1984年生，博士研究生l王迪，男．1983年生，博士研究生；4共同第一

4、作者△通讯作者，Correspondingauthor。王晶E-maillwangjingll@mail．hust．edu．cn；胡俊波E—mail：jbhu@Oh．timu．edu．cn在电穿孔实验中，d为两电极之间的距离，是一个定值，故本文所指的电场强度的选择即电压的选择。对于动物细胞来说，电场强度通常选择1～1000V／cm，并遵循低电场长时程的原则。电场强度的大小对DNA摄入量的影响主要有：在阈电场强度Ec(Ec=Uc／1．5R)以下无DNA摄入；适中的场强下，DNA的摄入呈电场依赖型，随场强的升高而增大；高场强下，DNA的摄入进入平台期，与电场的大小无关。电场

5、强度的大小对细胞存活率的影响主要有：在阈电场强度以下存活率无变化；在适中的场强下，存活率呈电场依赖型，随场强的升高而下降；存活率在高场强下降为0。因此，要保证较高的转染效率，必须综合考虑DNA摄入量以及存活率两个方面。不同的细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方式除了实验直接测定比较不同场强下(对悬浮细胞来说，取1～3倍的阈电场强度，对贴壁细胞来说可升至5倍)转染率的高低之外，还可以采取较为简便的间接法[5]。文献显示存活率在50％左右的电场参数为较理想的参数，故可间接测定存活率来确定最佳场强值。2．2脉冲时程时间常数为电容与电阻的乘积，是设定的电压呈指数衰减到37％的时

6、间。电脉冲的时间长短对电转染效率有较大的影响，太长、太短都会使转染效率下降。最佳时间的确定主要取决于细胞的大小，细胞越大，穿透胞膜所需的脉冲时程越长。电转染真核细胞的脉冲时程一般控制在ms级(不小于1ms)。电脉冲之前，DNA和细胞随机分布于电极之间；电脉冲早期，DNA和细胞向阳极运动；电脉冲后期DNA分子撞向细胞阴极面或末端，并且插入细胞外膜或者进一步进入细胞膜间隙，随后在孵育期万方数据杨薇等．质粒电穿孔转染条件的选择·859·间，DNA通过内膜渗透进入胞质。因此电压脉冲有双重效应，即驱使DNA快速向阳极运动以及向受体细胞表面渗透[6]。电脉冲的时间太短，则不能使DN

7、A分子有效进入细胞[1一]；而电脉冲时间过长，细胞局部过热可导致不可恢复的损伤，同时电泳所引起的细胞内外的物质进出(如Na+／K+浓度差的破坏)都可引起细胞存活率下降，转染效率的提高被抵消。真核细胞基因转染一般遵循低电场长时程的原则。长时程(一般20～60ms)可使细胞上的穿孔更大，开放时间更长。此外，适当地延长时程也能降低电穿孔的阈电场值，加大电场依赖性吸收的斜率，提高平台期电场值的放大作用。2．3脉冲次数脉冲次数的选择一般为1～10次，实验证明对于大多数细胞系较理想的脉冲次数为3～4次。第1次脉冲后，外加的电场开始在细胞膜上穿孔，第2