质粒转染实验步骤-2

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1、质粒转染大肠杆菌材料试剂:胰化蛋白月东，酵母提取物,琼脂，NaCI,NaOH(调pH),氨节青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，42°C恒温水浴锅，，恒温摇床(37°C,225rpm),无菌培养板，消毒l・5ml离心管，消毒枪头，无菌操作台1.LB培养基的配制：在950ml去离子水中加入：胰化蛋口月东10g酵母提取物5gNaCI10g摇动容器直至溶质溶解•用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L•在15psi高压下蒸汽灭菌20min.固态培养基LB固体培养基及倒板：

2、(1)・配制:lOOmILB培养基加入l・5g琼脂粉(2)•抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55°C的水浴中，待培养基温度降到55°C时(手可触摸)加入氨节抗生素(终浓度为5011g/ml),以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。(3)•倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。(4).保存：用封口胶封边，并倒置放于4°C保存，一个月内使用。2.从・70°C冰箱屮取200口1感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。1.加入

3、质粒DNA溶液（含量不超过50ng,体积不超过10山），轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。2.42°C水浴中热击45s/90s,热击后迅速置于冰上冷却3・5分钟。3.向管中加入lmlLB液体培养基（不含Amp）,混匀后37°C振荡培养1小时，使细菌恢复止常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）o4.将上述菌液摇匀后取：LOOyl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37°C培养16・24小时。同时做两个对照：对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替

4、DNA溶液，其它操作与上而相同。此组正常情况下在含抗生索的LB平板上应没有菌落出现。对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5卩1菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生人量菌落。大肠杆菌的扩增1.从LB平板上挑取新活化的单个菌落，接种于3-5mlLB液体培养基中，37°C下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1：100-1：50的比例接种于100mlLB液体培养基中,37°C振荡培养2・3小时至OD600=0.5左右。2.取上述培养液置于冰中lOm

5、in,之后转移到已灭菌的50ml离心管中再于冰上放置5min1.于4°C离心，2700rmp,lOmin,弃上清，收集细菌2.质粒的提取准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液3.质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳）质粒转染细胞株材料细胞株、质粒、培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA消化液、转染试剂（LipofectamineTM2000）实验步I•准备细胞：贴壁细胞：转染前24h,在500応无双抗完全培养基中接种0.5-2X10'个细胞，转

6、染时细胞融合度为80-90%o（注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。）II.对于每个转染样品，按下面的方法准备：（1）用50Opti-MEM稀释0.8曲质粒DNA,轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5mine（2）轻轻颠倒混匀转染试剂，用50mOpti-MEM稀释2.0也LipofectamineTM2000,轻轻吹吸3-5次混匀,室温下静置5min。（3）混合转染试剂和质粒DNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20mine注：转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染

7、。（4）转染复合物加入到24孔细胞板中，100吐/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。（5）将细胞板置于37°C、5%C02培养箱中培养6h左右，进行换液,换成含10%血清的普通培养基，在37°C,5%CO2孵育箱屮继续培养24h左右。稳定转染细胞株的筛选（各种细胞用什么抗生素筛选呢）从37°C,5%CO2孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用PBS冲洗细胞2遍，胰蛋白酶消化，接种1/2的细胞到100mm培养皿中，加入含500pg/mlG418的新鲜培养基，每2・3天更换一次新的筛选培养基，每天观

8、察细胞的死亡情况。当正常细胞完全死亡后,换用新的不含G418的培养基培养。每天观察细胞生长状态。在细胞达到60%汇合率时再用含500

9、ig/mlG418的培养基筛选一次。当细胞达到90%以上汇合率时将细胞转移至培养瓶中继续培养（转染后10-12天左右）。以后每隔4-5天再用含500

10、ig/mlG418的培养基筛选。直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染后15天左右）。以后继续培养时加入的G418浓度降一半。