质粒转染实验步骤.pdf

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1、质粒转染大肠杆菌材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒1.5ml离心管，消毒枪头，无菌操作台实验步骤：1.LB培养基的配制：在950ml去离子水中加入:胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.固态培养基LB固体培养基及倒板：（1）.配制：100mlL

2、B培养基加入1.5g琼脂粉（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置不55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。（3）.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。2.从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。3.加入质粒DNA溶液（含量丌超过50ng，体积丌超过10μl），轻轻摇

3、匀，冰上放置30分钟后。4.42℃水浴中热击45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。5.向管中加入1mlLB液体培养基（丌含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。6.将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。同时做两个对照：对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作不上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2：以同

4、体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl菌液涂布于丌含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。大肠杆菌的扩增1.从LB平板上挑取新活化的单个菌落，接种于3-5mlLB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1：100-1：50的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。2.取上述培养液置于冰中10min，之后转移到已灭菌的50ml离心管中再于冰上放置5min3.于4℃离心，2700rmp，10min，弃上清，收集细菌4.质粒的

5、提取准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液5.质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳）质粒转染细胞株材料细胞株、质粒、培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA消化液、转染试剂（LipofectamineTM2000）实验步骤Ⅰ.准备细胞：贴壁细胞：转染前24h，在500µL无双抗完全培养基中接种0.5-2×105个细胞，转染时细胞融合度为80-90%。(注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。)II．对于每个转染样品，按下面的方法准备：（1）用50µLOpti-ME

6、M稀释0.8µg质粒DNA，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。（2）轻轻颠倒混匀转染试剂，用50µLOpti-MEM稀释2.0µLLipofectamineTM2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。（3）混合转染试剂和质粒DNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。注:转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。（4）转染复合物加入到24孔细胞板中，100µL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。（5）将细胞板置于37℃、5%CO2培养箱中培养6h左右，进行换液，换成含10%血清的普通培养

7、基，在37℃，5％CO2孵育箱中继续培养24h左右。稳定转染细胞株的筛选（各种细胞用什么抗生素筛选呢）从37℃，5％CO2孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用PBS冲洗细胞2遍，胰蛋白酶消化，接种1/2的细胞到100mm培养皿中，加入含500µg/mlG418的新鲜培养基，每2-3天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。当正常细胞完全死亡后，换用新的丌含G418的培养基培养。每天观察细胞生长状态。在细胞达到60%汇合率时再用含500µg/mlG418的培养基筛选一次。当细胞达到90%以上汇合率时将细胞转移

8、至培养瓶中继续培养（转染后10-12天左右）。以后每隔4-5天再用含500µg/mlG418的培养基筛选。直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染后15天左右）。以后继续培养时加入的G418浓度降一半。生物实验高清视频，细胞、分子生物学、蛋白检测技术实验高清视频教程点击