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1、质粒的构建：1. 酶切反应按照1ugDNA需1-10u内切酶的用量，在反应体系中加入相应的10×缓冲液，内切酶的体积不得大于总体积的十分之一，ddH2O补足体系，如需长时间消化，还需加入适量的BSA已稳定内切酶活性。2. DNA片断的回收欲回收的DNA片断经琼脂糖凝胶电泳分离后，切下所需片断所在的凝胶（胶的体积尽可能小），加入3倍体积的BufferQX1,及适量的QIAXⅡ(Glassmilk),55℃10分钟，每隔2分钟涡旋1次，待凝胶完全溶解，12000转离心1分钟，BufferQX1洗涤沉淀1次以消除剩余凝胶.。再用BufferB
2、洗涤沉淀2次，将沉淀晾干，加入适当体积的ddH2O,离心后收集上清，琼脂糖凝胶电泳确定回收效率。3. DNA片断3凹端的补平于Eppendorf管中依次加入DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10×）2ul,加水至19ul。然后加入1-5单位Klenow酶，混匀后室温下反应15分钟。待补平反应结束后，于65℃水浴20分钟使Klenow酶失活，电泳定量后即可用于连接反应或-20℃保存备用。4. DNA片断3凸端的补平 于Eppendorf管中依次加入DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液
3、（10×）2ul。,加水至19ul。然后加入1-2单位T4噬菌体DNA聚合酶，12℃温育15分钟，于75℃加热10分钟，使T4噬菌体DNA聚合酶灭活。5. 载体的脱磷酸化：载体质粒经内切酶酶切后可直接进行脱磷酸化处理。40ul的酶切反应体系，景点永建车酶切完全后可加入10×CIAP（牛小肠碱性磷酸酶）缓冲液5ul,水4ul和适量CIAP进行脱磷酸化反应。CIAP的用量依载体5端磷酸的摩尔数及末端性质而定，对于5突出的末端，每100pmol5末端磷酸需1单位CIAP，对于5凹端或平末端，每2pmol5端末端磷酸需1单位CIAP,一般2ug5
4、kb的线性化质粒DNA约翰1.4pmol5端磷酸。反应条件：1）5突出末端：加入CIAP后于37℃反应30分钟，再加另一小份CIAP(加入量依DNA量而定)，继续反应30分钟。2）5凹或平末端：加入CIAP后于37℃反应15分钟，56℃反应15分钟，再加另一小份CIAP(加入量依DNA量而定)，又于37℃反应15分钟，56℃反应15分钟。反应结束后，加300ulCIAP反应终止液（10mMTris-ClpH7.5,1mMEDTApH7.5,200mMNaCl,0.5%SDS）,依次用酚、酚/氯仿和氯仿抽提，加0.5倍体积7M醋酸铵，2倍体积
5、酒精沉淀，室温晾干，溶于适量TE缓冲液中。6. 连接反应用适当的内切酶酶解载体和插入片断，DNA片断回收后电泳检查比较二者的浓度，按载体：插入片断1：4-6的比例将二者加入到连接反应体系中，加入10×连接缓冲液1ul,补水至10ul,取出1ul作连接前对照，然后加入1单位的T4DNA连接酶（平末端连接加入5单位的T4DNA连接酶），12-14℃水浴中过夜，平末端连接在20-22℃进行。次日，转化大肠杆菌感受态细胞。7.感受态大肠杆菌制备 将宿主菌的单菌落接种到5mlLB培养基中，37℃振摇过夜，次日，取1/50体积的过夜菌液接种到50-1
6、00mlLB培养基中，37℃振摇，待菌液OD600接近0.3-0.4时，于4℃4000转离心10分钟，收集菌体，取原菌液体积的1/5体积预冷的0.1MCaCl2溶液，轻轻加至菌体中，冰浴上轻轻摇动离心管，使菌体缓慢散开，冰浴静置20分钟，4℃离心，弃上清。重复上一次操作，同样条件离心收集菌体后，向菌体中加入1/50体积预冷的CaCl2,混匀，冰浴静置12小时后用于转化。感受态细胞于4℃保存一周仍可维持较高效率，或加入1/10体积的DMSO冻存于-70℃保存。8. 转化取新鲜制备的感受态细胞溶液100ul置于1.5ml管中，加入5-10ul
7、连接反应液，轻轻混匀后，冰上静置30分钟，然后置于42℃水浴中热休克90秒，加入0.5mlLB培养基，37℃振摇40分钟，然后接种于含氨卞青霉素的LB平板上，37℃孵箱培养10-12小时后观察菌落生长情况。或用快速转化法：取新鲜制备的感受态细胞溶液100ul置于1.5ml管中，加入5-10ul连接反应液，轻轻混匀后，冰上静置5分钟，然后涂布于经37℃预热2小时的含氨卞青霉素的LB平板上，37℃孵箱培养10-12小时后观察菌落生长情况。该方法适用于质粒和粘端连接产物的转化。9. 质粒DNA的小量制备在1.5mlEppendorf管中，加入过夜
8、培养的转化细菌液，12000转离心30秒，弃上清，加入100ul溶液Ⅰ（25mMTris-ClpH8.0,10mMEDTApH8.0,50mMSucrose）震荡混匀，在加入20
