脐带血NKT细胞体外扩增及其表型探究.doc

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1、脐带血NKT细胞体外扩增及其表型探究作者：刘嫌，范华骅，阮鸣，高踩，聂晓绚，杨懿铭，陆华中，高峰【摘要】目的建立体外有效扩增脐带血NKT细胞的方法及其表型的研究。方法分别采用单加IL-2,及同时加IL-2和a-半乳糖神经酰胺(a-Galcer)的方法，从人脐带血单个核细胞(UCB-MNCs)中扩增NKT细胞。用流式细胞检测技术测定NKT细胞(TCRVa24+TCRVB11+)的比例及其他表型特征。结果UCB-MNCs在第7天时，其TCRVa+NKT细胞的扩增量占淋巴细胞的(24.48±4,19)%,是原来的(8.74±4・37)X102倍(P<0

2、.01),且大多不表达NK1.1(CD161)；TCRVB11+较TCRVa24+髙表达。结论a-Galcer对脐血NKT细胞有特异地扩增功能。以表型划分，脐血中的NKT细胞多为NK1.1-,—种新的NKT细胞亚型。【关键词】脐带血；NKT细胞；a-Galcer；细胞表型TheproliferationofnaturalkillerTcellsinumbilicalcordbloodandthedifferentphenotypebetweenthem[Abstract】ObjectiveThefirstobjectiveofthisstudyw

3、astoestablishaneffectivemethodtoproliferatenaturalkillerT(NKT)cellsinumbilicalcordblood(UCB).Thesecondonewastostudythephenotype・MethodsMononuclearcells(MNCs)fromUCBwereculturedinthepresenceofIL~2(lOOU/ml),withorwithoutalpha-galcer・TCRValph824VbetalldoublepositiveNKTcellsandit

4、sotherphenotypesweredeterminedbyflowcytometry.ResuItsAfter7daysexpansion,TCRVaB+NKTcellsfromUCB-MNCsincreased(8.74±4・37)X102times,butmostofthemdidnotexpressNK1.1anditsTCRV11+washigherthanTCRVa24+.ConclusionHumanTCRValpha24Vbetal1doublepositiveNKTcellscanexpandfollowingtheadmi

5、nistrationofalpha-galcer・MostoftheUCB-NKTwasNK1.1一，anewsubsetofNKTcells・[Keywords]umbilicalcordblood；naturalkillerT(NKT)cells；alpha-galcer；phenotype脐带血是一种来源广泛的新资源，其中的低免疫原性细胞正日益受到人们的关注。近研究发现，构成机体免疫系统的淋巴细胞中，除T、B、NK细胞外，还存在一种新的细胞系—NKT细胞。这种细胞不仅其本身具有抗肿瘤、抗病毒和抑制自身免疫性疾病的功效，而且还能刺激T、NK等

6、免疫细胞的活性，增强其细胞毒效应，抑制GVHD的发生。但是，NKT细胞在脐血中的含量极少，很难用于临床研究和治疗。本文拟探讨一种高效的体外扩增脐血NKT细胞的方法，并同时分析它的表型特征，现报告如下。1材料与方法1.1试剂与仪器Ficoll-Paque细胞分离液（Phamarcia公司）；12孔细胞培养板（Corning公司）；RPMI1640培养基（Gibico公司）；KRN7000（alpha-galactosylceramide，简称a-Galcer,日本麒麟公司惠赠，100ng/ml）；IL-2（R&；D公司）；PE标记的TCRVa

7、24、CD161及FITC标记的TCRV311单克隆抗体（Immunotech公司）；6%務乙基淀粉生理盐水溶液（B.Braun公司）；EPICSELITEESP型流式细胞仪（Beckman-Coulter公司）。1.2方法1.2.1脐带血单个核细胞(UCB-MNCs)的制备新鲜采集的正常人脐带血以ACD-B抗凝血袋收集，继以体积比4：1加入6%HES液中，吹打均匀后4匸下静置lh,吸取中间白膜层用0・6%ACD-PBS对倍稀释，混匀后以2：1的比例加入Ficoll±层，离心(2000rpm,20min),取中间细胞环，PBS洗3次，悬浮于含10

8、%FCS的完全培养液中。1.2.2脐带血中NKT细胞的扩增将新鲜分离的UCB-MNCs接种于含10%FCS完全培养液的12孔细胞培养板中