脐带血nkt细胞的体外扩增及其表型研究论文

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1、脐带血NKT细胞的体外扩增及其表型研究论文.freelbilicalcordbloodandthedifferentphenotypebet【Abstract】ObjectiveThefirstobjectiveofthisstudyethodtoproliferatenaturalkillerT（NKT）cellsinumbilicalcordblood（UCB）.ThesecondoneUCBl），inedbyfloetry.ResultsAfter7daysexpansion，TCRVαβ+NKTcellsfromUCB-MNCsincreased（8.74±4.37

2、）×102times，butmostofthemdidnotexpressNK1.1anditsTCRVβ11+anTCRValpha24Vbeta11doublepositiveNKTcellscanexpandfolloinistrationofalpha-galcer.MostoftheUCB-NKTbilicalcordblood；naturalkillerT（NKT）cells；alpha-galcer；phenotype脐带血是一种来源广泛的新资源，其中的低免疫原性细胞正日益受到人们的关注。近研究发现，构成机体免疫系统的淋巴细胞中，除T、B、NK细胞外，还存在一

3、种新的细胞系—NKT细胞。这种细胞不仅其本身具有抗肿瘤、抗病毒和抑制自身免疫性疾病的功效，而且还能刺激T、NK等免疫细胞的活性，增强其细胞毒效应，抑制GVHD的发生。但是，NKT细胞在脐血中的含量极少，很难用于临床研究和治疗。本文拟探讨一种高效的体外扩增脐血NKT细胞的方法，并同时分析它的表型特征，现报告如下。1材料与方法1.1试剂与仪器Ficoll-Paque细胞分离液（Phamarcia公司）；12孔细胞培养板（Corning公司）；RPMI1640培养基（Gibico公司）；KRN7000（αlpha-galactosylceramide，简称α-Galcer，日本麒

4、麟公司惠赠，100ng/ml）；IL-2（RD公司）；PE标记的TCRVα24、CD161及FITC标记的TCRVβ11单克隆抗体（Immunotech公司）；6%羟乙基淀粉生理盐水溶液（B.Braun公司）；EPICSELITEESP型流式细胞仪（Beckman-Coulter公司）。1.2方法1.2.1脐带血单个核细胞（UCB-MNCs）的制备新鲜采集的正常人脐带血以ACD-B抗凝血袋收集，继以体积比4：1加入6%HES液中，吹打均匀后4℃下静置1h，吸取中间白膜层用0.6%ACD-PBS对倍稀释，混匀后以2：1的比例加入Ficoll上层，离心（2000rpm，20mi

5、n），取中间细胞环，PBS洗3次，悬浮于含10%FCS的完全培养液中。1.2.2脐带血中NKT细胞的扩增将新鲜分离的UCB-MNCs接种于含10%FCS完全培养液的12孔细胞培养板中，每实验孔接种密度为5×105/ml，分设实验组MNCs+IL-2（5u/ml）和MNCs+α-Galcer（100ng/ml）+IL-2（5u/ml），并以MNCs单独培养作为空白对照组。37℃，5%CO2及饱和湿度的条件下培养。1.2.3形态观察双相倒置显微镜，每12h观察细胞形态1次。1.2.4NKT细胞的含量及表型检测吸取100μl培养的细胞，各加入20μlPE标记的TCRVα24、CD

6、161及FITC标记的TCRVβ11单克隆抗体，避光孵育15min，加入0.5mlPBS，做双荧光检测，测定第7天和第14天TCRVα24+Vβ11+NKT细胞含量及其他表型特征。1.3统计学处理采用SAS6.0统计软件作配对t检验。2结果2.1脐血NKT细胞的扩增2.1.1IL-2刺激单个核细胞中NKT的扩增扩增后脐血TCRVαβ+NKT细胞占淋巴细胞的比例：第7天时，UCB-NKT为（0.29±0.09）%；第14天时，为（0.24±0.28）%。与MNCs单独培养组相比，脐血NKT细胞的扩增效率较原来差异无显著性（P＞0.05）。见表1。2.1.2α-Galcer和I

7、L-2联合刺激单个核细胞中NKT的扩增加用α-Galcer后，NKT的扩增效率有明显提高，占淋巴细胞的比例：第7天时，UCB-NKT为（24.48±4.19）%；第14天时为（12.15±2.02）%。尤其是培养到第7天的UCB-NKT是原来的（8.74±4.37）×102倍，与MNCs单独培养组和MNCs+IL-2组相比，差异均有显著性（P＜0.01）。见表1。Tab1TheproliferationofUCB-TCRVαβ+NKT（n=6）Notes：paredUCB-NKT3讨论已证实人类NKT细胞的数量下降