人NK细胞体外高效扩增实验探究

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1、人NK细胞体外高效扩增实验探究作者：黄庆生，李琦，黄勇，商澎，张明杰【摘要】目的：建立人NK细胞体外大量扩增的方法。方法：采用基因工程方法，在K562细胞上同时表达IL15、IL18、41BBL3种基因，构建特定的K562工程细胞作为刺激细胞。IL15、IL18基因分别与一段特殊的跨膜蛋白基因融合，41BBL直接跨膜表达，使这3种蛋白在K562细胞中表达后锚定于细胞膜表面。其次，以照射致死的该K562工程细胞作为刺激细胞，以人外周血单个核细胞(PBMC)为扩增培养对象，通过与IL2的共刺激作用，使NK细胞

2、在体外培养条件下得到大量的扩增。结果：经过21d的刺激培养后，CD56+CD3-细胞数量扩增了(520±75)倍。CD56+CD3-细胞的纯度从培养前占PBMC的7%±4%到扩增后占总细胞比例的93%±3%oPBMC中的T细胞基本上没有得到扩增，扩增后的细胞中CD3+细胞只占2%±1.2%。扩增的细胞具备了NK细胞的基本特征和生物学特性，除了CD56+CD3-外，还对扩增的NK细胞上NKG2D、NKp46、NKp44、NKp30、CD94、CD158b、CD158a.NKB1、NKAT2等标记进行了验证。

3、细胞毒实验表明，在效应细胞：靶细胞为5：1时，扩增的NK细胞的杀伤率达到了95%±4%O结论：建立的NK细胞体外扩增方法，达到了较高的扩增水平，且扩增的细胞活性较好。本方法以PBMC为原始材料，能够实现NK细胞体外的大规模制备，这将为抗病毒与抗肿瘤的NK细胞免疫治疗奠定基础。【关键词】扩增；自然杀伤细胞；白细胞介素15；白细胞介素18；41BB配体NK细胞(naturalldllercell)的过继治疗在抗病毒、抗肿瘤的治疗中有着广泛的应用前景，在造血干细胞移植后减少移植物抗宿主反应中的作用也倍受关注[1

4、,2]o由于NK细胞在外周血中所占的比例很少，建立一种有效的NK细胞体外扩增系统是深入研究NK细胞功能与探讨NK细胞免疫治疗的基础。体外获取人NK细胞主要有两种途径：一是采用抗NK细胞特异性抗体与磁珠交联的方法，从PBMC中分离人NK细胞；二是采用刺激扩增培养的方法，从PBMC中扩增培养人NK细胞。前者可以快速获得NK细胞，但只适用于小规模的NK制备用于研究分析。后者则是以PBMC(或以磁珠分离的NK细胞)为原始材料，通过特定细胞因子的刺激，使NK细胞在体外得到特异的扩增[3,4],这种方法是目前被认为比

5、较有应用前景的方法，通过体外的刺激培养可进行相对大规模的NK细胞制备，使临床应用成为可能。但是迄今为止多数的体外刺激扩增培养也只能使NK细胞在体外扩增数十到百倍，且纯度也不理想。在刺激NK细胞生长上，已知IL2、IL15、IL18和IL12等细胞因子在对NK细胞的生长与扩增是非常重要的，其中IL15的作用尤为重要。除了细胞因子对NK细胞的生长具有促进作用外，研究人员还注意到K562、HFWT等肿瘤细胞也能够刺激NK细胞的扩增。研究表明，IL15处于细胞膜上比其可溶状态能更有力刺激NK细胞的生长[5,6]o

6、Imai等[7]研究证明，如果单纯将K562细胞与可溶形式的IL15混合后刺激NK细胞，结果与以往的单纯细胞因子刺激或者肿瘤细胞刺激相比没有太大的差别，只能使NK细胞扩增数十倍。但是，如果将IL15表达在K562细胞的表面（非可溶形式的IL15）,使IL15基因及41BBL基因与跨膜蛋白基因融合，共同表达在K562细胞的膜表面。这样，通过V射线照射致死的该刺激细胞与PBMC的共同孵育（刺激细胞与NK细胞间的接触刺激），经过3周时间的培养，NK细胞得到大量的扩增，明显高于目前报道的各种扩增方法。我们在上述方

7、法的基础上进行改进，在K562细胞膜表面表达IL15与41BBL的同时，将IL18也同时表达在K562细胞的表面，以该细胞为刺激细胞，对其在NK细胞扩增中的作用进行了实验研究。1材料和方法1.1材料PBMC分别来自8个健康献血者（男女各4人），其中年龄最大45岁，最小22岁，平均38岁。K562细胞、含CD8a信号肽和穿膜区基因的真核表达载体本室已构建；IL15、IL18、41BBLcDNA分别从正常人淋巴细胞中扩增；抗人CD56、CD3、CD94、NKG2D、NKp46、NKp30、NKp44、CD15

8、8b、CD158a.NKB1.NKAT2特异性抗体购自美国BDBiosciences公司及Coulter公司；NK杀伤活性检测采用日本同仁化学研究所（Dojindo）的CellCountingkit8试剂盒。RPMI1640为GibcoBRL公司产品。1.2方法1.2.1表达IL15、IL18、41BBLK562细胞的构建采用RTPCR方法分别从人PBMC中扩增IL15、41BBL.IL18cDNA,测序正确后，IL15、IL