体外扩增高纯度的人外周血来源的nk细胞的研究.doc

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1、体外扩增高纯度的人外周血来源的NK细胞的研究作者：李晓红马健汪菲菲窦立萍李猛高春记【摘要】本研究探讨从人外周血中分选及扩增高纯度NK细胞的优化技术。先用miniMACS及阴性免疫磁珠分选方法，从外周血单个核细胞得到纯化的NK细胞，随后在干细胞培液基条件下，通过IL2、IL12和IL15等细胞因子的不同组合将培养体系分为IL2组、IL2+IL12组、IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组和对照组，分别培养15天，每3天半量换液并补充细胞因子；检测分选及扩增前后NK细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组在不同效靶比下的

2、杀伤率。结果显示经：miniMACS阴性免疫磁珠分选后NK细胞含量由分选前的±%提高到±%。培养15天后除对照组NK细胞纯度略下降外，其余4组与扩增前无显著性差异。在IL2、IL2+IL12、IL2+IL15、IL2+IL15+IL12培养体系中，NK细胞扩增倍数分别为土，土，土和土，均显著高于对照组土，但IL2+IL15与IL2+IL15+IL12组间未见显著差异。各组扩增的NK细胞对K562细胞的杀伤率均较扩增前增强，在不同效靶比下IL2+IL15、IL2+IL15+IL12组对K562细胞的杀伤率显著高于其他组，

3、但两组间无显著性差异。结论：经miniMACS免疫磁珠阴性分选得少量NK细胞后，应用IL2+IL15培养条件是获得高纯度NK细胞的简单有效方法。【关键词】NK细胞；miniMACS；白介素2;白介素12；白介素15ExVivoExpansionofHighlyPurifiedNKCellsfromHumanPeripheralBloodAbstractAdoptiveimmunotherapyusingallogenEicnaturalkiller(NK)cellsprovidestobeusefulinrecipie

4、ntsafterallogenEIchematopoieticstemcelltransplantation(AlioHSCT),butitsapplicationhasbeenlimitedbytheinabilitytoobtainsufficientnumbersofpureNKcells.ThisstudywasaimedtooptimizetheationKitII.expansionofhighpurityNKcellsfromhumanperipheralblood.First,theNKcellswer

5、eisolatedfromPBMNCbyusingminiMACS(magneticcellselection)andNKCelllsolThentheisolatedcellswereculturedinSCEM(StemlineHematopoieticStemCellExpansionMediumSigma)supplementedwithlO%humanABserumanddifferentcombinationsofIL2and/orIL12,IL15forl5days.Cultureswerefedwith

6、freshmediaandcytokinesevery3days,andwereevaluatedforcellexpansion,phenotype,andcytotoxicityattheendofthecultureperiod.TheresultsshowedthatingroupIL2+IL15andIL2+ILlfoldre5+IL12,cellswereexpanded+and土spectively,muchhigherthanothers,且目前尚缺乏有效的体外扩增体系，所以NK细胞的广泛临床应用受到了

7、限制。目前的许多体外研究均显示IL2、IL12、IL15对促进NK细胞的分化成熟、活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。本研究从方法学角度探索提高NK细胞纯度并采用IL2、IL12、IL15等细胞因子的不同组合，以期优化NK细胞体外扩增的效率及纯度，为NK细胞的进一步临床应用奠定基础。材料NK细胞分选试剂盒及miniMACS磁珠分选系统、分离柱均购自德国美天意公司。造血干细胞扩增培养基(StemlineHematopoieticStemCellExpansionMedium,SCEM)为Sigma公司产品，RPMI1640

8、培养液为Gibco公司产品。人AB血清购自杭州四季青生物制品公司。IL2、IL12、IL15为Cytolab公司产品。左旋谷氨酰胺为Sigma公司产品。流式细胞仪及荧光抗体FITCCD3、PECD56.FITCIgGl、PEIgGl均为BectonDickinson公司产品。CCK8试剂盒购自日本同仁化工。K562细胞为我科实验室