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1、外泌体分离提纯草案By朱旭峰一、以超高速离心的方法来分离外泌体（细胞上清）1.1细胞培养液(CM)是来自无菌的80%-90%的培植细胞，并用浓度比1:1.000的蛋白酶抑制剂混合。（sigma）1.2快速地将CM用0.22μm的过滤筛(Millipore)过滤，来分离完整地细胞和残渣。超速离心于120,000_g(SorvallWXULTRASERIES,rotorA-641)4℃.2小时1.3用1mL冷的PBS重悬和清洗小囊泡，再次超速离心120,000_g(SorvallWXULTRASERIES,rotorA-641)4℃.2小时1.4再用100μL冷的PBS重悬后转
2、移到低粘附的管中1.5快速地使用或置于-80℃中待用为检测外泌体的蛋白浓度，取2μL的样品置于卡上，用DirectDetect™(Millipore)2材料a)细胞培养液b)蛋白酶抑制（Sigma）c)过滤筛(Millipore)d)冷的PBSe)低粘附的管f)DirectDetect™(Millipore)二、以超高速离心的方法来分离外泌体（人血浆）1.1在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂(Sigma)1.2将上清液移至一个新的管中离心200*g20分钟4℃1.3小心地再将上清液移至新的管中离心10000*g30分钟于4℃来去除较大的囊泡、1.
3、4此阶段的样品可以1.5将样品用0.22μm的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g(SorvallWXULTRASERIES,rotorF65L)2小时4℃1.6用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g,1h,4℃).，1.7将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬1.8外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏2.材料a)蛋白酶抑制（Sigma）b)过滤筛(Millipore)c)冷的PBSd)低粘附的管e)DirectDetect™(Millipore)三、ExoQuickTM化学沉淀法1.1ExoQuickTM的使用要按照厂家提供的说明书来实行1.
4、2该试剂盒可以简单地提取CM,人血浆，和血清里的外泌体，只需用倒相管按照所指示的量来加入ExoQuickTM试剂盒里的溶液1.3溶液孵化过夜，在4℃温和的摇晃1.4在流式细胞仪缓冲液中洗涤1.5试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定，用流式细胞仪鉴定即可(BDBiosciences)配合使用CellQuest的软件。2材料a)ExoQuickTM试剂盒b)流式细胞仪四、用METM分离外泌体1.1样品（CM或人血清）要按照商品说明书(NewEnglandPeptide–NEP)稀释1.2样品要事先处理好，17,000g7分钟来去除微粒物质1.3然后用METM试剂来孵化样品(NE
5、Ppeptide)并且用旋转震荡在室温混合15分钟1.4孵化完的样品要室温离心10000g7分钟1.5所有的样品要用PBS洗三次1.6最后小囊泡要用合适的KIT缓冲液重悬五、抗体以下的外泌体有关的一抗和二抗是用作：WestenBlot，ELISA和FACS（流式细胞术）1.1mAbaCD9,mAbaCD63,mAbaCD81,mAbaCD63-FITC,aCD81-PE,来自于BecktonDickinson,1.2mAbaCD63-biotin(BioLegend),1.3mAbaAlix(SantaCruz),1.4mAbaTsg101(Abcam),1.5pAbaRa
6、b5(SantaCruz),1.6mrAbaRab5(Epitomics),1.7mAbaCalnexin(Abcam),1.8二抗是anti-Mouse和anti-RabbitHRP-conjugated(Dako).专门的肿瘤外泌体(HBM1andHBM2)结合抗体由HansaBioMedR&Dteam.提供六、用WestenBlot探测外泌体的蛋白1.1将样品用合适容积的蛋白loadingBuffer（Lonza）重悬在合适的浓度下1.2用SDS-page分离外泌体的蛋白质1.3把蛋白转到硝酸纤维素膜上（GEHealthcare）1.4一二抗体孵化1.5信号要在暗室里
7、用ECL附加七、外泌体免疫捕捉和蛋白定量ELISA1.1从已经加了不同抗体的96孔板(Nunc)里的细胞上清或者人血浆为免疫捕捉而筛选外泌体结合抗体（96孔板的抗体用碳酸氢盐缓冲液PH=9.6稀释，用0.5%BSA固定和1%的蔗糖稳定）1.2PBS加入0.05%Tween-20（PBST）作为洗涤缓冲液，但如果有提示说明，应该用PBS稀释样品1.3将外泌体样本，CM，人血浆样本加入96板孔内（最终容积为100μl），孵化4℃过夜或者室温2小时（可以使用商业化的exosomes捕捉平板(HansaBioMed)）1.
