外泌体蛋白质组.ppt

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1、外泌体参与肺炎相关的急性胰腺炎14级生技目录CONTENTS第一部分

2、摘要背景第二部分

3、材料方法摘要背景1Abstract急性胰腺炎的常见并发症是肺损伤相关的全身炎症反应。尽管研究发现在局部和全身都会产生促炎因子，但对疾病的致病机制仍不清楚。外泌体作为细胞间通讯系统出现，有转运膜包被的蛋白质和小分子RNA，并保护其免受退化的作用。用牛磺胆酸盐诱导的大鼠急性胰腺炎模型，评估外泌体在全身性炎症反应程度的作用急性胰腺炎外泌体大鼠急性胰腺炎模型蛋白质组诱导胰腺炎升高了循环外泌体的浓度，得到与对照组动物不同的蛋白质组图谱研究概述PKH

4、26染色和跟踪实验表明，循环外泌体能到达肺泡隔间然后被巨噬细胞吞噬体外实验表明，外泌体在炎症条件下活化肺泡巨噬细胞并使其朝亲炎症性分化跟踪实验还表明，肝脏保留了来自腹腔的大部分外泌体对急性胰腺炎的循环外泌体进行蛋白质组分析，提示多器官来源的囊泡对外泌体的作用效果像一个来源的外泌体可能是作为相关介质参与肺损伤相关的急性胰腺炎材料方法2分离外泌体143625分离外泌体血浆样本（1ml)4℃2000×g离心10min10000×g离心30min回收上清8mlPBS30%蔗糖垫120000×g超速离心70min去蔗糖PBS洗涤0.2

5、2μm滤膜过滤120000×g超速离心70min（清除外泌体相关非特异性蛋白和大分子蛋白）从PAAF分离纤维颗粒（纤维蛋白含量高）分离上清分离出的外泌体定量分析——测蛋白质含量样本用5U/ml凝血酶处理10min10000×g离心5min电子显微镜34214%甲酸铀酰负染风干网格吸附在聚乙烯醇缩甲醛树脂包被的镍网格外泌体结合4%多聚甲醛5电子显微镜观察SDS-PAGE和Westernblot从RIPAbuffer（含蛋白酶抑制剂）提外泌体Odyssey红外成像系统，观察免疫条带细胞裂解液作阴性对照洗印记，孵二抗（Dyligh

6、t-800)室温1.5hCd63抗体（1:500）隔夜孵化PBS+3%BSA封闭1h含（1:10PAAF）血浆处理外泌体5min外泌体降解实验转到PVDF膜12%SDS-PAGE分离体外巨噬细胞活化巨噬细胞暴露在2μg/ml的循环外泌体从对照组动物供体获得含外泌体的肺泡巨噬细胞培养16h外泌体染色和跟踪分析PKH26标记外泌体300kDaNanosep超滤离心管PBS洗3次洗去多余染料3%BSA停止反应1min实验11实验2AP血浆样本得到的Exo-PKH26以4ml/h的流速注射下腔静脉15minPAAF样本中得到的Exo

7、-PKH26以4ml/h的流速注射15min肝门静脉下腔静脉处死，取肺泡巨噬细胞（注射肝门静脉）取肝荧光免疫分析每组PKH26染PBS作对照荧光免疫检测体外条件下，通过肝门静脉向肝灌注4%40ml多聚甲醛PBS+1.5%BSA、5%FCS封闭切10μm样本房子载玻片上样本组织在异戊烷冰浴冻存（O.C.T混合物）蔗糖梯度（10%-40%）冷冻保存M-CD163（1:100）单克隆抗体、M-Alexa488二抗预处理切成小块PBS洗荧光免疫分析3421分离肝细胞50×g离心3min将每次获得的上清液合并180×g离心回收KC取肝

8、，切成小块，用刮刀使其分散，将悬液用孔径为100μm的细胞过滤器过滤向肝部体外注射含0.05%IV型胶原酶的汉克平衡盐溶液5KC加到24孔板底部，附着2h除去非粘连细胞观察肝细胞的形态，用KC对抗CD163荧光染色检测分离细胞的纯度LC-MS分析蛋白提取物用测序级蛋白酶裂解，FASP(超滤管酶解)，每个胰蛋白酶多肽混合物用TMTs标记。混合6个标记过的缩氨酸，浓缩，用C18SPE滤芯脱盐。标记的样本通过分成3份，用带有nanoESI离子源的LTQ-OrbitrapXL进行LC–MS分析用ProteinDiscoverer软件

9、搜索数据库通过以下参数，:源性容差性,20ppm;片段公差,0.8Da；酶，胰朊酶,未酶切位点,1；固定修饰,半胱氨酸碘乙酰胺化，TMTsixplex(N-端,K)；修改变量，氧化(M).用DanteR相关定量和统计学分析TMT-标记的肽段THANKYOU!