如何分离纯化、鉴定外泌体

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1、如何分离纯化、鉴定外泌体外泌体相关研究逐渐从小众走向大众,受到越来越多的关注,涌现了一大批的外泌体课题。但大家还是感觉外泌体研究好难啊!为什么呢?首要原因就在于该领域里还木有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法。今天就来给大家聊一聊如何搞定外泌体研究中的第一步。一、分离超速离心法:超速离心法是外泌体分离最常见的技术之一。据不完全统计,约有1/2的研究者会选择该种方式分离外泌体。该方法由几个离心步骤组成,可分步去除细胞、细胞碎片和大囊泡,沉淀外泌体(如图所示)。但该种方法用于血浆和血清等粘性生物液体时效率较低,且重复离心操作有可能对外泌体造成损害,从而降低其质量。如将超速离心配合蔗糖溶液进

2、行梯度密度离心可得到纯度更高的外泌体,是公认可以得到最高纯度的分离方法。但此法对离心时间非常敏感,一般需要8-30h,产率较低,同样不适用于血浆和血清等粘性生物液体中外泌体的分离,因此难以广泛普及。聚合物沉淀法:第二大主流的外泌体分离技术就是基于聚合物的沉淀法了,最常见的聚合物是聚乙二醇(PEG)。通常将含有聚合物的沉淀溶液与生物体液混合,4℃温育,低速离心,沉淀外泌体(如图所示)。目前已有成熟的PEG-base商业试剂盒,比如图中的ExoQuick™(SystemBiosciences)。这类试剂盒使用容易和快速,不需要额外的设备,且随着产品不断更新换代,提取效率和纯化效果逐渐提高,因

3、而逐渐取代超速离心法并推广开来。沉淀法的主要缺点是分离物中会有少量的聚合物存在。不过大家不用担心,一般来说这些物质不会干扰下游分析,使用商业试剂盒提取外泌体也受到越来越多杂志的认可。二、鉴定外泌体的鉴定是继分离后又一个困扰研究者的问题。如果大家看过外泌体研究相关的文献,就肯定对一张图印象深刻。不错,想发外泌体文章,光找到高效率的分离方法还不够,要过的第二关就是证明你分离得到的就是外泌体。鉴定方式不外乎就是下面这三种:1.形态学(电镜);2.粒子大小(径粒分析);以及3.标志蛋白(WB)。综合来说,透射电镜可以清楚的看到外泌体的大小、形态等,属于鉴定方法中的金标准,其他两种方式则常常作为辅

4、助使用。三、得到了外泌体之后如何做外泌体携带大量功能性的miRNA,少量的mRNA、lncRNA,以及特异性的蛋白质(如细胞因子、生长因子)等生物活性物质,在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程,与多种疾病的发生和进程密切相关。对外泌体验明正身之后,就可以在蛋白水平和核酸水平对其进行检测和深入分析了。由于外泌体中含有较多降解的短RNA片段,测序时会成为背景干扰有效数据,通常都建议使用芯片的方法检测外泌体miRNA。而对于lncRNA来说,大部分在细胞内低表达,在外泌体中丰度就更低了,对于低丰度基因,芯片检测的准确性远远大于测序,因此也建议使用基因芯片的方法检测外泌

5、体lncRNA。

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