重组类生物制品蛋白原液检验.ppt

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1、重组类蛋白制品各项检测参考资料目录前言原液检定半成品检定成品检定一、前言重组DNA蛋白制品是采用重组DNA技术，对编码所需蛋白质的基因进行遗传修饰，利用质粒或病毒载体将目的基因导入适当的宿主菌，从而表达并翻译成蛋白质，经过提取纯化等步骤制备而成的具有生物学活性的蛋白制品，用于疾病的预防和治疗。质量控制的必要性药品要求使用安全、有效、合理质量控制与分子大小、结构特征、质量属性复杂程度以及生产工艺相关。二、原液检定理化检定生物检定残余杂质检定理化检定蛋白含量紫外光谱纯度分子量等电点鉴别试验肽图N端氨基酸序列蛋白质含量检测目的：其他检测项目检测的

2、前提制备药物制剂前提方法：凯氏定氮法福林酚法（Lowry法）双缩脲法BCA法考马斯亮蓝法紫外-可见分光光度计法紫外光谱检测目的：对于某一重组蛋白来说，其最大吸收波长是固定的，在生产过程中每批产品的紫外吸收光谱应当是一致的检测方法：用水或者生理盐水将样品稀释至100-500μg，在光路1cm、波长230-360nm处进行扫描纯度目的：纯度是重组类蛋白质药物检测重要指标之一检测方法：SDS-PAGE非还原电泳HPLC法分子量目的：对于某一重组蛋白来说，其相对分子质量应该是一致的检测方法：SDS-PAGE还原型电泳等电点目的：生产过程中，批与批之

3、间重组蛋白的等电点应当是相对一致的检测方法：等电聚焦电泳毛细管电泳鉴别试验目的：对于重组类蛋白药物来说，其具有抗原性检测方法：免疫印迹免疫斑点肽图目的：肽图分析可作为与天然产品或参考品的蛋白质一级结构作精密比较的手段，与氨基酸组成和序列分析合并研究，可作为蛋白质一级结构的精确鉴别。方法：裂解法：化学法蛋白酶裂解法特殊方法处理分析法：反相HPLC、SDS-PAGE电泳、毛细管电泳、质谱分析N端氨基酸序列目的：蛋白质结构的重要指标检测方法：基本原理为Edman化学讲解法現已有全自动蛋白测序仪生物学活性检测目的：基因工程的化学本质是蛋白质、多肽，

4、其活性由产品的氨基酸序列及其空间结构决定。其生物学活性是蛋白质药物的重要质控指标。活性测定必须采用国际上通用的方法，用国际或国家标准品对测定结果进行校正，以国际单位或指定单位表示。方法：体外测定法体内测定法酶促反应测定法免疫活性方法残余杂质检测宿主菌残余蛋白质宿主DNA残留量检测残余抗生素残留量细菌内毒素宿主菌残余蛋白质目的：在临床上需要反复多次注射的药品，则需要做残余宿主菌蛋白质含量测定方法：双抗夹心ELISA宿主菌DNA残留量宿主菌DNA具有致癌性，是其所含的可编码活性致肿瘤基因的特异性DNA序列。方法：DNA探针杂交法荧光染色法残余抗

5、生素目的：生产工艺原则上不使用抗生素。如果使用了抗生素，不仅要在纯化工艺上去除，也要对终产品进行检测。最常用的抗生素是氨苄西林抗生素残留量检测法（培养法），依据抗生素的抑菌作用，此实验仅为定性实验。细菌内毒素检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，内毒素为外源性致热源，可引起发热反应。方法：细菌内毒素可以引起凝胶反应，从而创立了鲎试剂检测法，此法现已广泛应用，此外还有光度测定法。制剂检测外观检测可见异物检测澄明度检测pH检测渗透压摩尔浓度检测水分检测装量差异（最低装量）无菌检测生物学活性鉴别实验外观、可见异物、澄明度检测是指在规定的条件下，肉眼

6、可观察到的。装量差异（最低装量）检测是考察制品的均匀性。pH检测：蛋白质是带电荷的，在其等电点处易沉淀。人体内环境是弱碱性的。水分测定目的：是对生物制品稳定性影响较大，水分越少，越稳定方法：费休氏法：1、容量滴定法、2、库伦滴定法烘干法减压干燥法甲苯法气相色谱法渗透压摩尔浓度生物膜具有半透膜性质，简单扩散属于渗透，阻止渗透所需要的压力成为渗透压，在涉及溶质扩散或通过生物膜的液体转运各种生物的过程，渗透压都起着极其重要的作用。因此在注射剂和眼用制剂中关注其渗透压是非常重要的通常采用冰点测定法。无菌（微生物限度）检测各类生物制品（除另有规定外）

7、都不应有外援微生物污染，无菌检测就是为了保证成品中没有杂菌污染。方法：直接接种法薄膜过滤法