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1、第40卷第1期2011年1月发酵科技通讯L-色氨酸生产菌质粒稳定性工艺研究黄静程立坤刘倩徐庆阳谢希贤陈宁（天津科技大学生物工程学院天津300457）摘要：从工程应用的角度研究L-色氨酸生产菌E.coliTRJH的质粒稳定性,采用30L自动控制发酵罐观察选择压力、温度、溶氧、酵母抽提物和葡萄糖浓度等条件对质粒稳定性的影响。结果表明，该菌具有分裂不稳定性，上述培养条件的变化均会对该菌的质粒稳定性产生较大影响。关键词：L-色氨酸发酵质粒稳定性L-色氨酸(L-tryptophan)的化学名称为α-氨大学工业微生物菌种保
2、藏室提供。基-β-吲哚基丙酸，是Hopkins和Cole在1902年1.2培养基发现并分离到的一种氨基酸[1]种子培养基(g/l)：葡萄糖20，酵母膏15，（NH。L-色氨酸对人和4）2动物的生长发育、新陈代谢起着重要作用,因此被SO410，柠檬酸钠0.5，MgSO4·7H2O5，KH2PO41.5，广泛用于医药、食品和饲料等领域[2]。近年来，随着FeSO4·7H2O15mg，VB1100mg，四环素50mg，重组DNA技术在微生物育种中的应用，为微生物5pH7.0~7.2，0.75×10Pa灭菌15min。
3、发酵法发酵生产L-色氨酸提供了重大的技术支发酵培养基(g/l)：葡萄糖20，酵母膏1，（NH4）2持，使得微生物发酵法成为大规模生产L-色氨酸SO44，柠檬酸钠2，MgSO4·7H2O5，KH2PO42，FeSO4·的首选技术。由于大肠杆菌具有遗传特性较清楚、57H2O100mg，pH7.0~7.2，0.75×10Pa灭菌15min。易培养、发酵周期短并能实现目的基因的高效表1.3培养方法达等特性，因而重组大肠杆菌得到广泛地应用[3]种子培养：吸取适量无菌生理盐水于5支活。大肠杆菌表达系统广泛用于异源蛋白的表达
4、,质化斜面(32℃培养24h)中，将所有菌悬液接入装粒稳定性是影响发酵产量的重要因素,丢失质粒2.0L种子培养基5L种子罐(上海保兴)中；初始通的空细胞的出现导致所表达蛋白的产量下降。一气量1L/min；搅拌转速300r·m·p~700r·m·p；通过般情况下,质粒增加了细胞的代谢负担,与含质粒自动流加氨水控制pH在7.0；培养温度32℃；以的细胞相比,丢失质粒的空细胞通常具有较高的泡敌消泡；待种子培养液OD600≈10~20时，接入比生长速率[4-5]发酵培养基中。,若空细胞出现在发酵初期,将会成为优势群体。
5、外源基因表达后,由于代谢负担的发酵培养：按10%接种量将种子液接入装增加,质粒稳定性迅速降低[6]。16.2L发酵培养基的30L发酵罐(上海保兴)中；初本文通过对不同选择压力、温度、溶氧、酵母抽始通气量2L/min；搅拌转速500r·m·p~800r·m·p；提物、和葡萄糖浓度的分析，优化了大肠杆菌(E.通过自动流加氨水控制pH在7.0；培养温度coliTRJH)生产L-色氨酸分批补料发酵工艺，显著32℃；以泡敌消泡；发酵过程中，培养基中葡萄糖提高了生产菌的质粒稳定性和L-色氨酸产量。浓度降至一定值时，将80%
6、葡萄糖溶液以一定的脉冲速度流加至培养基中且维持发酵液中的葡萄1材料与方法糖浓度在所需浓度范围。1.1菌种1.4质粒缺失率的检测大肠杆菌TRJH(trpEDCBA+tetR)，天津科技平板点种法：选择几个培养时间,随机挑取在—15—发酵科技通讯第40卷非选择性培养基上生长的菌落,分别点种在对应复制速率跟不上细胞分裂的速率[10]。发酵过程分的选择性培养基和非选择性培养基平板上,观察别采用不同的温度(28℃、30℃、33℃、36℃)发酵两种平板中菌体生长情况,计算两种平板上生长36h时，采用平板点种法考察质粒的缺失
7、情况。试的菌数比例,验证质粒的缺失率[7]验结果如图2所示。。1.5分析方法1.5.1菌体生物量：菌体生物量以菌体干重表示，取10ml发酵液，1000r·m·p离心20min，将菌体用蒸馏水洗涤2次后置于真空干燥箱中80℃干燥至恒重，用分析天平称重。1.5.2葡萄糖浓度：采用SBA-40C（山东科学院生物研究所）生物传感仪测定。1.5.3L-色氨酸浓度：L-色氨酸含量采用高效液相分析系统测定，色谱分离条件：AgilentC18(15图2温度对质粒稳定性的影响mm×4.6mm,3.5μm)，流动相V(0.03%K
8、H2PO4溶液):由图2可知，36℃时虽然获得最高的菌体量，V(甲醇)=90:10，流速1ml/min，检测波长278nm；乙但是产酸却不是最高的，质粒丢失比较严重。说明酸浓度测定采用RP-HPLC[8]温度升高使生产菌比生长速率过大从而增加了质。粒分配不稳定性。28℃时质粒基本不丢失，但是过2结果与讨论低的温度使菌体生长缓慢产酸下降。因此需要选2.1选择压力对质粒稳定性的影响择一个适
