质粒dna生产实用工艺地研究进展

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1、实用标准综述：质粒DNA生产工艺的研究进展一、质粒DNA细菌质粒（plasmid）是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分，除了酵母的杀伤质粒（killerplasmid）是一种RNA质粒之外，迄今所知的所有质粒无一例外地都是属于这种类型的DNA分子[1]，质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代[2]，为了更好地适应细胞的生理特点，质粒主要以细长并具有负超螺旋结构的形式存在于原核细胞中[3]。环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：超螺旋型（SC）质粒DNA；开环型（OC）质粒DNA和线性（L）质粒DNA分子[

2、4]。用于基因工程改造的质粒载体通常包括复制子、选择标记和目的基因和启动子[5]，为了获得高稳定性、高产量的质粒DNA，在构建质粒DNA时，需仔细从以下几个方面着手考虑。1.质粒复制子的选择Prazeres[6]报道到2010年，以质粒为核心的基因免疫和治疗的市场产值将会超过450亿美元，质粒DNA的需求不断加大。因此，无论从科学还是经济角度出发，在构建DNA疫苗和基因治疗用途的质粒时，为了提高质粒产量，复制子的选择非常关键，目前，绝大多数学者选择拷贝数高且仅需宿主编码蛋白的ColE1复制子[7]。在携带文案大全实用标准ColE1复制子的质粒中，RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复

3、制的负调节物，另外，由质粒编码的一种Rop/Rom蛋白可提高RNAI与RNAII结合的效率，增强RNAI的负调控作用，因此，Rop/Rom基因缺失至少可使colE1质粒拷贝数提高3至4倍[8]。Yavachev和Wang[9-10]研究报道非荷载的转移RNA的二氢尿嘧啶环、反义环和CCA序列可与RNAI或RNAII的环有高度的同源性，从而会影响到质粒DNA的复制，但是其具体机制还有待进一步的研究。据Minton[11]报道，pUC19系列载体同样被缺失了rop基因，但其与其他缺失rop基因的质粒在拷贝数上的表现却不尽相同，这是由于pUC质粒在RNAII序列上带有一个G到A的点突变，可依温度

4、的不同而改变正向调节分子RNAII的二级结构，ChambersS&Yanisch-PerronC等研究表明在42℃或者45℃下，RNAII似乎折叠成抗RNAI抑制的构型，于是DNA合成的起始加强，结果拷贝数特别高[12-14]。尽管构建DNA疫苗时普遍使用ColE1类型复制子，但UhlinB&RemautE报道的一种由低拷贝发展而来的由温度控制的“失控型”复制子同样具有巨大的应用前景，这种失控的质粒可使质粒DNA大量积聚在大肠杆菌中，其拷贝数可以高达1000[15-16]，AnsorgeM和ChaoY证实这种拷贝数已成功地应用来表达大量的重组蛋白[17-18]，尽管“失控型”复制子的优势非

5、常明显，但还没有使用这个类型复制子来构建DNA疫苗的成功例子，至今不清楚什么是导致此种复制子未得到开发的具体原因[19]。文案大全实用标准2.抗性基因的选择在选择抗生素抗性基因时，由于极少量即可引起部分人群强烈的过敏反应，首先应避免β-内酰胺类抗生素的使用，而应考虑氨基糖苷类的新霉素和卡那霉素[20]，因为这些氨基糖苷类的抗生素在临床上很少使用，且无耳毒性、肾毒性等副作用，所以更为合适[19]。3.其他元件的考虑设计、构建DNA疫苗和基因治疗质粒载体的策略已经十分明显，它除了必须包括一个能使质粒在大肠杆菌中维持、分裂的元件；一个能促使目的基因在机体内表达的元件和选择标记外，还包括其他一些调

6、控元件，以促使转基因的表达和质粒的稳定[21]，这些元件包括真核启动子、终止子及其终止信号等，启动子是外源基因在动物细胞内获得表达的必要前提，常见的有CMVI/E、SV40、EF-1α及UbC和MHCI等，CMV比SV40[22]和UbC[23]等更为有效，其中内含子A更能提高CMVI/E的表达水平[22]，CMV现已被广泛使用在商品化载体上，这对商业开发DNA疫苗来说是十分有帮助的。另外，一些抗原基因本身来源的启动子也可用来构建DNA疫苗，但对于想同时表达多个抗原基因的质粒而言，此种启动子的效果不明显；常用的转录终止子及终止信号包括牛生长激素（BGH）、SV40及人β-珠蛋白。此外，在构

7、建DNA疫苗时，可利用非甲基化的细菌DNA-CpG寡脱氧核苷酸来优化整个质粒，提高DNA疫苗的免疫原性，这是因为真核生物CpG的概率只有原核生物的1/16左右[24]，这种频率上的差异使得其与模式识别受体TLR-9的相互作用，提高了免疫应答水平[25]。文案大全实用标准4.目的基因在选择和构建质粒DNA时，首先应考虑的是质粒DNA可否整合入宿主基因组，因此，在选择目的基因时，须严格避免目的基因同人类基因组之间具有长片断的