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1、氨基酸和生物资源2004,26(1):41~43AminoAcids&BioticResourcesL-谷氨酰胺生产菌的选育和发酵工艺优化夏海平,汤海达,黄红芳(上海迪赛诺生物技术有限公司上海201302)摘要:用上海迪赛诺原L-谷氨酰胺生产菌种GB20为出发菌株,利用亚硝基胍诱变方法进行诱变筛选,获得目标株-13GB20-9090,再以目标株为发酵菌种,经过发酵过程的工艺优化,在5L小发酵罐生产水平达75gL以上,在70M发酵罐-1生产水平达70gL以上。关键词:L-谷氨酰胺;亚硝基胍;工艺优化中图分类号:TQ92文献标识码:A文章编号:1006-8376(2
2、004)04-0041-03L-谷氨酰胺(Gln)作为人体必需的氨基酸,广02%,七水硫酸锌0.05%,硫酸铵7.0%,一水硫-1泛用于治疗神经衰弱、脑出血后遗症的记忆障碍,用酸锰质量浓度100mgL,五水硫酸铜质量浓度于促进智力不足儿童的智力发育,作为消化道溃疡的-110mgL,pH7.0。原料药以及作为健美运动和健美爱好者的重要营养1.1.3试剂和仪器[1]补剂,应用前景极为广泛。由于L-谷氨酰胺微生物1.1.3.1玉米浆购于浙江海盐六和淀粉厂;亚硝基发酵法工业化大生产目前国内厂家不多,我们通过对胍:SIGMA公司产品;其余均为国产试剂,化学纯。原有生
3、产菌株的诱变育种和发酵工艺条件的优化,使1.1.3.2581-G型光电比色计:上海华光仪器仪3我公司的70M发酵罐L-谷氨酰胺微生物发酵法生表厂;SKW-3型微量呼吸检压仪:上海科技大学-1-1产水平从原来的55gL提高至70gL.工厂;pH计:PHS-2ST型数显酸度计上海天达仪器有限公司。1材料与方法1.2方法1.1材料1.2.1分析方法1.1.1菌种1.2.1.1细菌生长(OD)测定方法上海迪赛诺生物技术有限公司生产菌种GB20。以蒸馏水为对照,菌液稀释适当倍数后用5811.1.2培养基-G型光电比色计于650nm处测定OD值。[2]1.1.
4、2.1固体培养基各成分质量分数:1.2.1.2还原糖(RG)测定方法牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%,氯化钠1.0%,采用斐林氏法测定。琼脂粉2.0%,pH7.0。1.2.1.3谷氨酰胺(Gln)测定方法1.1.2.2摇瓶种子培养基各成分质量分数:采用瓦勃氏法测定:用SKW-3型微量呼吸检葡萄糖2%,玉米浆0.6%,磷酸二氢钾0.压仪测定样品用碱水解前后的谷氨酸含量,然后计02%,七水硫酸锌0.05%,pH7.0。算得到谷氨酰胺(Gln)含量。1.1.2.3摇瓶发酵培养基各成分质量分数:1.2.1.4pH值测定葡萄糖15%玉米浆0.6%磷酸二氢钾0.02%全
5、部采用PHS-2ST型数显酸度计测定。七水硫酸锌0.05%,硫酸铵7.0%,碳酸钙5%,[3]1.2.2诱变方法-1一水硫酸锰质量浓度100mgL五水硫酸铜质量收集在液体培养基中培养了12h的菌种,用-1浓度10mgLpH7.0。pH7.0的磷酸缓冲液洗涤3次后用玻璃珠分散(震1.1.2.4发酵罐发酵培养基各成分质量分数:荡15min),再用pH7.0磷酸缓冲液稀释制成细胞浓葡萄糖15%,玉米浆0.6%,磷酸二氢钾0.4度10/mL左右的菌悬液。取菌悬液至15mm150mm的无菌试管中,加入亚硝基胍(NTG)500g收稿日期:2004-08-18-1mL
6、,于30~32恒温震荡30min后离心收集菌作者简介:夏海平(1970-)发酵工程师体,然后再用pH7.0磷酸缓冲液洗涤3次,适当稀42夏海平等:L-谷氨酰胺生产菌的选育和发酵工艺优化释后分别涂布于不同磺胺胍(SG)浓度(300、400、mL),从中筛选出了5株高产菌株(摇瓶考察)结果-1500gmL)的筛选培养基平板上,于30~32培如表1。养3d,挑选出生长良好、菌落较大且规则的单菌落表15株高产菌株摇瓶考察结果于斜面培养基上培养23h后放于0~4冰箱中待菌株编号SG抗性浓度(g/mL)Glu(g/L)Gln(g/L)用。GB-90583000.
7、825.441.2.3培养方法GB-90724000.655.781.2.3.1斜面培养GB-90824000.745.92GB-90885000.685.84恒温培养间培养,温度30~32,培养时间23h。GB-90905000.536.311.2.3.2摇瓶种子培养250mL三角瓶装量25mL,每瓶接斜面菌种一在对GB20-9090菌株的考察中该菌株产谷氨环,置于往复式摇床(120rpm)30~32培养10h,酰胺达6.31%,而且产谷氨酸(Glu)较低,其性能明至吸光度(OD)1.0。显优于其它高产菌株。随后我们对该菌株进行了传1.
