庆大霉素高产菌的选育及其发酵条件优化研究

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1、第一章绪论通过筛选对磷霉素敏感的突变株来获得GMCl。的高产菌株，使正变率达至iJ73．3％，效价提高119％；颉红梅等报道了离子辐射可使菌种的生长周期缩短40h，效价也有所提高。80年代，随着细胞融合技术的成熟，人们开始采用原生质体融合的方法，实现小单孢菌的种问和属间的融合，匈牙利的Szvobodal91等人首先报道了棘孢小单孢菌和伊尼奥小单孢菌的种内原生质体融合，他们发现甘氨酸浓度在制备小单孢菌原生质体过程中是至关重要的，但他们是以抗生素为选择标记；1983年，南朝鲜的Ruy[10J等人采用蔷薇小单孢菌(M．rosari

2、a)为材料，以营养标记作为选择手段，成功地进行了蔷薇小单孢菌的种内融合，并将融合后的遗传重组率与常规杂交的重组率进行了比较，结果表明通过原生质体融合可以得到高频重组，而且这种重组是稳定的；中国科学院微生物所的柳君科等以产链霉素的灰色链霉菌(Sgriseus)No．45和产庆大霉素的棘孢小单孢菌M814为材料，使亲缘关系比较远的属间融合获得成功；进入90年代，基因工程技术有了很大的发展，人们开始用基因工程的手段来改造小单孢菌，到目前为止，小单孢菌还没有建立起合适的载体和受体系统；吴健【lI】等对低能矿离子、紫外线和60Co丫射

3、线对绛红小单孢菌产庆大霉素的诱变效应进行了初步研究。目前大多数工厂对庆大霉素提高发酵单位的措施主要是菌种诱变。胡永松【12】等研究发现采用硫酸--7,酯(DES)和庆大霉素(GM)复合处理有较强的正变效果，亚硝基胍的诱变效果最差；还连栋【13】等研究表明庆大霉素生产能力与菌落大小和颜色有一定的相关性，橙色的小菌落单位较高，菌落大而呈紫色效价较低g周普等发现，对于绛红小单孢菌丝和孢子的诱变效应进行比较，结果表明菌丝诱变效果更佳。在筛选方面，葛祥斌【14J等认为抗生素发酵过程中，次级代谢产物的反馈抑制作用是影响抗生素发酵效价继续

4、提高的重要因素，因此，通过诱变分离出对庆大霉素具有耐受性的新菌种，是提高庆大霉素发酵效价的有效方法；复旦大学陈孝康等申请的一项专利中，用筛选抗甲硫氨酸结构类似物突变型菌株的简便方法，获得庆大霉素组分比例合适的生产菌株：M．Himabindu等在产生突变以后筛选青霉素和卡那霉素抗性的突变株；国内也有研究采用青霉素来筛选细胞壁缺陷型，以及抗自身结构类似物的方法进行筛选。另一方面，在改变培养基成分和代谢途径方面做了一些探索。刘华【l5】等人报道，加入三十烷醇(TRIA)有利于产抗；某些研究表明，加入甲硫氨酸可促进庆大霉素各组分之间

5、的转化；国外有人考察了碳源对产抗的影响并认为氨对产抗有刺激作用等。1．3．3GM发酵液分析方法研究目前，各国药典中(包括BP，1977版)对于庆大霉素的检测主要是还是针对C组分，采用的方法多为衍生化的HPLC方法。但由于衍生化后Cl组分前后存在很多杂峰，而且衍生化产物的紫外吸收系数间也存在差异，影响了检测结果的稳定性和准确性。而且衍生化操作复杂，给检测带来不便，同时HPLC的流动相中添加的药品价格不菲，也提高了科研和生产的成本。为了完善GM检测方法，科研工作者也进行了很多的尝试，王明娟等人利用蒸发光散射检测仪(ELSD)作为

6、检测手段，避免了衍生化的繁琐并且分离效果较好；陈志伟等人利用核磁共振氢谱(HNMR)峰面积积分法建立了一种测定庆大霉素C组分比率的方法，方法较为简单，无需对照品；刘本剔16J等人对紫外分光法进行江南大学硕士学位论文了研究；祝仕清【17】等人建立庆大霉素的LC．MS分析方法，对GM组分进行了定性和定量的检测研究；针对发酵液的检测，还有人利用磷钨酸与庆大霉素反应生成沉淀，研究并建立紫外分光光度法检测发酵液中庆大霉素的浓度，类似的检测方法还有雷氏盐比色法㈣等。而薄层色谱分析(TLC)是最早被开发用于分析庆大霉素C组分的方法，该方法

7、具有操作方便简单，检测成本低等优点，主要问题在于色谱系统不稳定，展开剂系统不成熟。李传响f191、赵长敏例、梅群口11、夏金尧1221、解翠竹1231、王锦【241等人都针对不同类型的庆大霉素产品C组分的TLC检测方法进行了研究，杨利红【25J等人则研究改进传统TLC方法，对HPTLC检测方法进行了研究。随着工业化的需求，简便、快速、准确的检测方法越来越受到青睐，TLC方法在庆大霉素的工业检测上也会越来越凸显其优势。通过与其他的分离检测方法互相结合，对庆大霉素的检测会取得更好的效果，当然这也需要我们科研工作者付出更多的努力。

8、1．3．4GM的工业生产情况我国庆大霉素的生产历史已有20多年，生产工艺改进不大【24】，整体状况不容乐观，大罐发酵仍维持在1100U／mL左右，据对全国多个生产厂家的跟踪调查，发酵罐单位维持在600-'-900U／mL的厂家约占40％，而发酵单位高于1200U／mL的只占25％左右，产量