PCR检测细菌16 s rRNA基因在临床感染性疾病诊断中应用.doc

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1、PCR检测细菌16srRNA基因在临床感染性疾病诊断中应用【摘要】目的建立检测临床常见细菌16srRNA基因的PCR方法。方法分析细菌16srRNA基因保守区，设计通用引物对7种常见细菌16srRNA基因进行PCR扩增；并用该方法检测临床血液标本中的16srRNA基因表达，与传统培养方法结果进行比较。结果7种标准菌株均出现特异阳性条带；感染性疾病血液标本16srRNA基因阳性表达。结论16srRNA基因PCR法可用于快速检测临床细菌感染。【关键词】聚合酶链反应；细菌；感染；16srRNA基快速、准确检测出机体内存在的病原菌是临床诊断细菌性感染疾病的重要指标，对疾病的及时、

2、有效治疗具有重大意义。传统的检测方法主要使用常规细菌培养，一般所需时间长，且阳性率不高，因此严重影响了疾病的诊治。应用聚合酶链反应(PCR)法检测细菌感染，具有快速、准确和特异的优点，利于对疾病的快速诊断和及时治疗。本研究建立了细菌16srRNA基因的PCR检测方法，旨在提高感染性疾病的检出率，以适应现代临床的需要。1材料与方法1.1材料7种标准菌株（大肠埃希菌、产气肠杆枯草芽抱杆菌、变形杆菌、伤寒沙门菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌）由本课题组教研室保存；临床血液标本40例，包括检查确诊的感染性病患血液标本30例与健康者血液标本10例。TaqDNA聚合酶、dNTPs、D

3、NAmarker等均购自大连宝生物公司，引物由上海生工公司合成。ASTECPCR扩增仪(PC-818),SYNGENE凝胶成像系统(G:BOX),Eppendorf高速离心机(5415R)O1.2方法1.2.1引物设计采用细菌16srRNA基因高保守区设计通用引物，上游引物F:51AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3口，下游引物R:5Q-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3n,扩增产物长度为371bpo1.2.216srRNA基因的获取挑取单个菌落，加入50pl抽提裂解液，100°C煮沸10min,12000rpm离心5min,取上清作为PCR扩增模板；抗凝

4、血液标本以500rpm离心5min,取血浆50pl,加入50pl抽提裂解液,处理步骤同上。1.2.3PCR扩增将标准菌株进行PCR扩增建立检测体系，PCR体系如下：模板2pl;上下游引物各1pl;10xTaqbuffer(MgDD2+Dplus)5pl;dNTPsMix(10mmol/L)1pl;

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8、»Taq酶(5U/pl)0.5pl;ddHEJEJ2EJO39.5pl;反应体系总量为50ploPCR反应条件：949预变性5min;949变性30s、559退火30s、729延伸30s,30个循环；最后于729延伸5min。以同样PCR体系条件扩增检测临床血液标本,将标

9、准菌株作为阳性对照，并与传统培养方法结果进行对比。2结果2.1标准菌株16srRNA基因扩增结果取5plPCR扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，以DNAmarkerDL2000作标准分子量，用凝胶成像系统观察电泳结果，见图4。PCR扩增后各菌株均在370bp附近出现特异的目的片段，与预计的片段大小吻合。2.2临床血液标本16srRNA基因扩增结果血液标本PCR扩增结果见图2。临床确诊的细菌感染病患血液标本均出现阳性片段，扩增的条带与阳性对照标准菌株（大肠埃希菌）的条带片段大小一致；而健康者血液标本与ddHnn2Q0的阴性对照结果未出现特异性条带。2.3PCR法与传统培

10、养法检测结果对比对40例临床血液标本分别进行细菌学培养与PCR检测，其中10例健康者血液标本经两种方法检测均为阴性。30例确诊感染的病患标本经培养检测14例大肠杆菌阳性、12例金黄葡萄球菌阳性、4例阴性，阳性检出率86.7%;培养法检出的26例阳性标本经PCR检测全部为阳性，另有2例培养呈阴性的标本经PCR检测后也呈阳性，阳性检出率达93.3%o虽两者比较未显示统计学显著性差异（P>0.05）,仍表明了PCR法的检出率有高于传统培养法的趋势。图1图2图1（左）7种标准菌株16srRNA基因片段PCR扩增结果M:DL2000、1:大肠埃希菌、2:产气肠杆菌、3:枯草芽电杆菌

11、、4:变形杆菌、5:伤寒沙门菌、6:流感嗜血杆菌、7:金黄色葡萄球菌、8:阴性对照（ddHnn2D0）图2（右）临床血液标本16srRNA基因片段PCR扩增结果MQL2000、■:阴性对照9加口口2口0）、+:阳性对照（大肠埃希菌）、1〜4:感染性病患血液标本、5:健康者血液标本3讨论有关感染疾病的诊断问题是当前临床研究中的重点，引起感染的病原菌种类繁多，如何快速获知为何种病原体感染，是临床实验室检验迫切需要解决的问题。一些致病菌的[>Z4i培养周期过长、分离技术复杂以及使用抗生素治疗等都会导致细菌培养检测面临困难[1],并且