细菌或原核生物 16S rRNA_微基生物

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1、细菌多样性分析—16SrRNA细菌核糖体RNA（rRNA）有三种类型：5SrRNA（120bp）、16SrRNA（约1540bp）和23SrRNA（约2900bp）。5SrRNA基因序列较短，包含的遗传信息较少，不适于细菌种类的分析鉴定；23SrRNA基因的序列太长，且其碱基的突变率较高，不适于鉴定亲缘关系较远的细菌种类；16SrRNA普遍存在于原核细胞中，且含量较高、拷贝数较多（占细菌RNA总量的80%以上），便于获取模板，功能同源性高，遗传信息量适中，适于作为细菌种群分析的标准。细菌多样性分析的流程图如下

2、：1.基因组DNA提取DNA的提取是整个宏基因组学研究的第一步，也是至关重要的一步。提取出来的DNA必须能够代表样品中所有存在的细菌，同时对于DNA的总量和质量也都有较高的要求。微基生物根据多年实验经验及摸索，根据不同来源的样品，采用适合的方法，保证DNA的质量。2.文库构建（1）引物设计16SrRNA基因由9个可变区（variableregion）和9个保守区组成（constantregion）（图1）。可变区拥有与进化距离相匹配的序列变化，能够体现物种间的差异，是细菌分类研究的理想材料；保守区的序列基本恒

3、定，反应了微生物物种间的亲缘关系，可利用其设计引物以扩增16SrRNA基因片段。图116SrRNA不同V区及其引物针对不同的V区，均有相应的引物可以对其进行扩增、比对（图1）。有学者分别对不同V区及其组合进行可全面的比较分析，研究发现，V4-V5区其特异性好，数据库信息全，是16SrRNA基因分析注释的最佳选择。（2）文库构建两步PCR扩增法根据illuminaMiSeq高通量测序要求，进行双向测序，设计16SV4-V5区域和带有“5’MiSeq接头-barcode-测序引物-特异引物-3’”的融合引物。并

4、采用两步PCR扩增的方法构建文库。图2两步PCR扩增示意图（来自Illumina官方说明）低偏差扩增（Low-ErrorAmpliconsequencingPCR,LEA-SeqPCR）根据发表在Science上的文献报道，采用LEA-Seq的方法对普通两步PCR扩增法进行优化，形成自己的一套低偏差扩增建库的方法。LEA-Seq扩增的原理为，首先加入低浓度的内侧反向引物，进行少数循环的目的片段扩增；随后加入内侧正向引物及外侧的正、反向引物，再进行目的片段的指数扩增。其示意图如图4所示：图4LEA-SeqPC

5、R示意图3.高通量测序目前市面上常用的用于研究环境微生物的高通量测序平台有IlluminaMiSeq，Roche454和IonTorrentPGM。针对于细菌的16SrRNA基因序列分析，MiSeq凭借其测序读长长、测序周期短、通量大等特点，成为使用最为普遍的测序平台。微基生物是国内首家采用illumina-MiSeq2×300bp平台进行微生物生态研究，其最大读长可达到550bp，适合对V3、V4、V5区及V3-V4、V4-V5区进行测序分析。4.生物信息分析5.分析结果案例分析标题：由长期的土壤移植引起的

6、纬度和气候变化明显改变了土壤微生物的变化率TheISMEJournal(IF:9.302)研究领域：土壤微生物分析物种及采样方法：分析物种：细菌取样方法：从中科院封丘站取1.4*1.2*1.0体积的土壤，分别向北移植到黑龙江海伦站，向南移植到江西鹰潭站。每组设3个重复，于2006-2011年每年的8-9月取20cm的表层土，密封在聚乙烯包装袋中，于-80︒C保存。高通量测序平台：IlluminaMiSeq2×150测序区域：16SrRNAgeneV4区样本数及分组：分3组，3个重复，共63个样本。研究背景：生

7、物群体对由某些人为因素造成的潜在威胁（如气候改变）的响应是目前生态学研究的一个重要挑战。鉴于微生物在生物地球化学循环中的重要作用，它们对气候改变的响应有可能导致生态结构的改变。之前已有研究指出，温度是影响土壤微生物组成和生态功能（土壤的呼吸作用、有机物的含量、固氮水平）的重要因素。而不同地域之间的土壤移植为研究微生物群落对气候变化的响应提供了新的研究方法和思路。主要结果：（1）微生物的演替随着时间的推移，向北、向南移植的土壤中，微生物的群落组成差异越来越大，微生物多样性逐渐增加。（2）由土壤移植引起的土壤微生

8、物的变化微生物随时间衰减的斜率可以用来衡量微生物群落的相似性。本研究中，在各个样本的微生物群落中都存在显著的的时间衰减关系。向北、向南移植的土壤中，微生物随时间衰减的斜率均比原位土壤的斜率大，尤其是在向南移植的土壤中。随着温度的升高/降低，微生物的变化率也相应地增加。随着土壤向南移植，气候变暖，微生物群落的波动性增大，微生物群落的变化增加。向南移植对土壤微生物群落的变化具有出更好的效果。有趣的是，研