16 S rRNA在细菌分类鉴定研究中的应用

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1、16SrRNA在细菌分类鉴定研究中的应用刘文强1，贾玉萍2，赵宏坤3(1.聊城大学农学院，山东聊城252059；2.山东大学生命科学学院，山东济南252100；3.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018) 摘　要：细菌的16S核糖体RNA(ribosomeRNA，rRNA)以其在进化上的特征性序列，现已被广泛用于细菌分类和鉴定的分子指标。其具体操作是，以聚合酶链式反应(PCR)分离细菌样本中的16SrRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得其序列信息，再与16SrRNA数据库中的序列数据进行比较，确定其在进化中的位置，从而鉴定样

2、本中可能存在的微生物种类。文章综述了16SrRNA作为微生物系统分子分类鉴定的理论基础和方法，以及在细菌分类鉴定中的应用。关键词：16SrRNA；细菌；鉴定；分类传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，采取的主要方法是对细菌进行纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴定。大量菌种的分类鉴定是一项繁琐、费时的工作，因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法，使人们在一定程度上更加科学、精确、快速地找到微生物的分类地位，为微生物资源的开发利用奠定基础。20世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅

3、速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用。CaiHY等[1]认为，rRNA基因序列己成为一个分子指标，可以广泛地用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究。目前，大量已知微生物的DNA都被测定并输入国际基因数据库，成为对微生物鉴定分类非常有用的参照系统，从而可以通过对未知微生物DNA序列的测定和比较分析，达到对其进行快速、有效的鉴定分类的目的。随着微生物核糖体数据库的日益完善，该技术已应用于海洋、湖泊和土壤、大气微生物菌群和病原微生物等环境微生物多样性的分析[2]。1　16SrRNA作为细菌分子鉴定的依据细菌

4、核糖体的RNA含有3种类型，即23SrRNA、16SrRNA和5SrRNA，它们含有的核苷酸分别约为2900个，1540个和120个。20世纪60年代末，Woese开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的rRNA特征序列，认为16SrRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。其主要依据为，它们为细胞所共有，其功能同源且最为古老，既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应。5SrRNA虽易分析，但由于核苷酸少，没有足够的遗传信息用于分类研究。而23SrRNA含有的核苷酸数几乎是

5、16SrRNA的2倍，分析较困难。与此相比，16SrRNA的相对分子质量适中，作为研究对象较理想。在相当长的进化过程中，rRNA分子的功能几乎保持恒定，而且其分子排列顺序有些部位变化非常缓慢，以致保留了祖先的一些序列。即rRNA结构既具有保守性，又具有高变性。保守性能够反映生物物种的亲缘关系，为系统发育重建提供线索；高变性则能揭示出生物物种的特征核酸序列，是属种鉴定的分子基础。而且rRNA在细胞中含量大，一个典型的细菌中含有10000个～20000个核糖体，易于提取，可以获得足够的使用量，供比较研究之用。根据核糖体16SrRNA结构变化规律，在所测

6、定的区域中包括了V1、V2、V3和V4共4个高变区，尤其是V2这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包含的信息，足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。因此，JohesSW和NellerHF等报道测定16SrDNA基因的部分序列即可达到对分离物进行分子鉴定的目的[3-5]。2　16SrRNA序列分析鉴定细菌的基本原理和方法通过比较各类生物16SrRNA的基因序列，从序列差异计算它们之间的进化距离，可以绘出生物进化树。因此，16SrRNA序列分析技术的基本原理就是从微生物样本中16SrRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16Sr

7、RNA序列信息，再与16SrRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。2.1　基因组DNA的获得首先从微生物样品中直接提取总DNA，对易于培养的微生物可通过培养富集后再进行提取。另一种选择是提取微生物细胞中的核糖体RNA。一个典型的细菌含有10000个～20000个核糖体，而基因组DNA中rrn操纵子(即rDNA序列)的拷贝数相对较少(原核生物一般为1个～10个左右)，因此，rRNA在细胞中的含量很高，易于获得较多的模板，但是RNA易于降解，RNA的提取技术相对于DNA的提取较为复杂，一般

8、研究多采用提取细胞总DNA，但也可根据情况选择提取rRNA。由于rRNA在死亡的细胞中很快降解，提取rRNA通过反转录钓取