亲和纯化技术教学教案.ppt

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1、亲和纯化技术利用生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术（Affinitypurification）123技术要点（1）找与底物专一可逆结合的配基；（2）将配基通过共价键偶联到基质；（3）配基与底物吸附；（4）洗脱目标物。4亲和纯化技术亲和层析(Affinitychromatography)亲和过滤（膜分离）亲和分配（双水相萃取）亲和反胶团萃取（反胶团萃取）亲和沉淀（沉淀）亲和电泳（电泳）5第一节亲和层析(affinityChromatography)利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的

2、特性而建立的层析技术。适用于从成份复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。6特点经过一次处理可得到高纯度活性物质。设备要求不高、操作简便、特异性强、分离速度快、分离效果好、分离条件温和。亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。7亲和吸附剂：载体—配基在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（Ligand）。与配基结合的层析介质称为载体（Matrix）。8一、亲和层析的原理（1）配基固定化：配基与载体偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。（2）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质。（3）样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活性物

3、质解吸。9二、亲和层析载体（一）亲和层析对载体的要求：（1）充分功能化，与配基进行共价连接。（2）有较好的理化稳定性和生物惰性。（3）具有高度的水不溶性和亲水性。（4）具有多孔的立体网状结构。（5）应为大小均匀的刚性小球。10（二）常用载体纤维素(cellulose)琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶多孔玻璃珠（Bio-Glass）其它载体——壳聚糖(Chitosan)111、纤维素纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。非特异性吸附力较强，空间位阻。主要用于分离与核酸有关的物质。122、琼脂糖凝胶琼脂糖浓度有2%、4%、6%，商品

4、为Sepharose2B、4B和6B（Pharmacia）。保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。SepharoseCL,稳定性明显增加，能在pH3~14中应用。133、葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，应用受到限制。4、聚丙烯酰胺凝胶：Bio-gelP有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。145、多孔玻璃珠：化学与物理稳定性较好，机械强度高。缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，化学活性基团

5、少。6、其它载体——壳聚糖15壳聚糖(甲壳素和壳聚糖)16三、亲和配基配基的选择配基的浓度配基偶联的位置配基分子的大小配基的类型17（一）配基的选择亲和层析配基的选用主要取决于分离对象。1、配基与配体有足够大的亲和力（亲和势）KL在10-4～10-8之间。2、配基与配体的结合应是专一的。3、配基应具有化学活性。18亲和势—KL（EL复合物的解离常数）19（二）配基的浓度对亲和势比较低的时候（KL≥10-4mol/L），增加配基浓度有利于吸附。增加亲和柱的长度来提高吸附率。配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。理想的配基浓度为1-10μmol

6、/L。20（三）配基偶联的位置配基固定化时，其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联。AMP-Sepharose亲和柱。腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到载体上，对甘油醛-3-磷酸脱氢酶有吸附力。21（四）配基分子的大小选用大分子配基。甘氨酸小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个“手臂”以消除空间障碍。22（五）配基的类型较小的有机分子或天然生物活性物质。根据配基应用和性质:特殊配基和通用配基。特殊配基（specialligand）1、特殊配基（specificligand）：指只与单一或很少种类的蛋白质等生

7、物大分子结合的配基。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配基都属于特殊性配基。特点：特异性高、分离效果好。缺点：配基不稳定，偶联时活性损失大，价格昂贵、成本高。24通用配基（generalligand）用于一类物质的分离提纯。用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配基；用ATP作激酶类亲和层析的通用配基；用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时的通用配基等。2、通用性配基（generalligand）：指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配基，如各种凝集素（lect

8、ine）可以结合各种糖蛋白、NADH作脱氢酶类的通用配基等。通用性配基对生物大分子的专一性虽然不如特异性配基，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配基还具有结构稳定、偶联率