免疫亲和纯化和免疫沉淀

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1、免疫亲和纯化和免疫沉淀技术泸州医学院免疫学教研室刘佳佳20010年4月亲和层析及沉淀的用途亲和层析及沉淀被认为是分离纯化酶及蛋白质的强有力的技术手段，这种方法可以较经济有效地使用配基，能够大规模、快速、特异性地分离、纯化酶及蛋白质。蛋白质的功能蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能。蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之中分离纯化出所需要得到的目的蛋白质的方法。蛋白质分离纯化技术是当

2、代生物产业和生命科学研究当中的核心技术。该技术难度和成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。生物工程上游技术:是理论的研究,技术的开发等,如：基因工程、蛋白质结构和功能研究等。生物工程下游技术：一般包括产物（一般为蛋白质）的预处理及分离纯化；产品的成型加工和质量监控等一系列单元操作和过程中的主要技术,其中生化产物及发酵产物的分离纯化是其核心内容。下游技术是生物工程重要组成部分,是生物高科技技术实现产业化的关键，如：酶工程,发酵工程等（提取干扰素、胰岛素和酶等）。蛋白质分离纯化的意义①从

3、生物材料中分离制备蛋白质，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需　要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。④基因工程的需要：DNA合成酶、RNA逆转录酶等。蛋白纯化策略分离蛋白质常用的纯化方法有超速离心和梯度密度离心法、盐析法、电泳、凝胶过滤（分子筛）、离子交换层析、亲和层析以及高效液相色谱等方法……。亲和沉析技术是纯化各种生物大分子最有效的方法之一。超速离心是分

4、离亚细胞及蛋白质大分子的有效手段，往往是进一步纯化的第一次过筛。超速离心又分差速离心和梯度离心。用超速离心或梯度离心分离和纯化抗原只是一种根据蛋白的比重特点分离的方法，除个别成分外，极难将某一抗原成分分离出来。目前仅用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲状腺球蛋白等，以及一些比重较轻的抗原蛋白如载脂蛋白A、B等。对于大量的中、小分子量蛋白质，多不适宜用超速及梯度密度离心作为纯化手段。盐析沉淀法是最古老而又经典的蛋白质纯化分离技术。由于方法简便、有效、不损害蛋白抗原活性等优点，至今仍被广泛应用。盐析法原理盐析沉

5、淀法的原理因为蛋白质是亲水性大分子，所以在水溶液中有双电层结构的水合膜，来保证分子的溶解度平衡并稳定存在。当加入盐时，盐会电离成离子态，离子的电性破坏了蛋白质的双电层的水合膜结构，从而使其沉降，析出。加入浓酸和浓碱是不行的，苛性的环境将使蛋白质变性。凝胶过滤和离子交换层析凝胶过滤又称凝胶柱层析、分子筛层析，利用微孔凝胶，将不同分子量的成分分离。离子交换层析是利用一些带离子基团的纤维素或凝胶，吸附带相反电荷的蛋白质，将蛋白质按带电荷不同或量的差异分成不同的组分。这两种层析如能共同应用或者反复应用其中的一种，皆可将某

6、一蛋白质从一复杂的组分中纯化出来。凝胶过滤(分子筛层析)图示1凝胶过滤(分子筛层析)图示2离子交换层析柱亲和层析是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。例如抗原和抗体（免疫亲和层析）、酶和酶抑制剂（或配体）、酶蛋白和辅酶、激素和受体等之间有一种特殊的亲和力，在一定条件下，它们能紧密地结合成复合物。如果将复合物的一方固定在不溶性载体或共价结合在一种惰性的微珠上，则可从溶液中专一地分离和提纯另一方。与上述其他纯化方法相比，亲和层析能产生相当高的纯化作用。另外，此法的优点是迅速

7、，有时仅一步即可达到纯化的目的。免疫亲和纯化技术亲和纯化(affinitypurification)是基于目标分子与固定化配体的特异性相互作用(如：抗原-抗体)。亲和技术可用来从混和物中分离特定分子。捕获目标分子用于相互作用研究,或从反应体系中去除某一成分。免疫亲和纯化原理免疫亲和纯化是一种分离各种生物大分子最有效的方法特点：1、高纯化率，通常为常规纯化的1,000-10,000倍以上。2、由于内在的背景限制，如目标抗原量非常稀少，需与其他方法结合才能获得均质性产物。3、快速纯化抗原，层析柱常可重复使用。可按照不

8、同规模进行，半天内即可完成。4、不仅适用于纯化抗原，也可用来分离经过初步纯化的抗体，乃至所有能与相应配体有效结合的生物分子。5、抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性，能大量分离天然状态或近似天然状态的抗原。6、需要适当纯化的抗体，不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析，但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就简单、快速、可靠。7、不能用于定量测定。免疫亲和纯化技术发展历