《亲和纯化技术》PPT课件

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1、亲和色谱定义亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。亲和色谱所用的固定相为键合亲和配基的亲和吸附介质（亲和吸附剂）亲和色谱原理亲和色谱操作与一般的固定床吸附操作方式相似，多采用断通式前端分析法，分为进料、杂质清洗、目标产物洗脱合层析柱再生四步。亲和色谱原理料液进料（feedstockloading）含有目标产物的料液连续通入色谱柱，直至目标产物在色谱柱出口穿透杂质清洗(contaminantwashing)利用与溶解原料的溶液组成相同的缓冲液为清洗液，清洗色谱柱除去不被吸附的杂质；产物洗脱(targetproductelution)利用可使目

2、标产物与配基解离的溶液洗脱目标产物柱再生（columnregeneration)利用清洗液清洗再生色谱柱亲和配基－酶、抗体和蛋白酶的抑制剂蛋白酶均存在抑制其活性的物质，称为酶的抑制剂。它的分布很广，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制剂（结合常数为109L/mol），也有小分子化合物如氨基苄脒（结合常数为4×104L/mol）。抗体抗体和抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数在107~1012L/mol蛋白A（或称A蛋白）A蛋白为分子量42kDa的蛋白质，存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁中。它与动物免疫球蛋白G（IgG）具有很强的结合作用。亲和配基－凝集素和色素

3、凝集素凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。在这种蛋白质上具有糖的结合位点。可作为多糖、糖蛋白等含糖生物分子的配基。辅酶和磷酸酰苷各类脱氢酶和激酶需要在辅酶存在下表现出其生物催化活性。辅酶和脱氢酶之间有亲和作用。三嗪类色素这类色素与NAD的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用，能与脱氢酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶等发生结合作用亲和配基－过渡金属等过渡金属离子Cu2+等过渡金属离子可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基发生亲和结合作用。Cu2+等过渡金属离子与N、O和S等供电原子产生配位键。组氨酸肝素肝素是存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质，分子量为5到3

4、0kDa，它与凝血蛋白质、脂蛋白等有亲和作用。亲和色谱-亲和色谱介质应满足条件具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；物理和化学稳定性高，有较高的机械强度含有可活化的反应基团粒径均一的球形粒子介质的活化方法－溴化氰法溴化氰活化法用于亲和色谱介质连接含有氨基的配基最初的溴化氰活化法，需要加入NaOH至pH为11，成功地将配基连接到软性介质上。但是，溴化氰是剧毒试剂，并且具有挥发性。溴化氰活化介质后形成的氰氧基容易水解，而影响偶联效率，活化后的介质带有较强的电荷，导致非特异性吸附增加等。介质的活化方法－环氧基法环氧氯丙烷活化具有方便、快速、活化率高，毒性低的特点，是

5、目前广泛采用的制备方法。活化方法：将介质用水冲洗后，加入环氧氯丙烷和适当浓度的NaOH，然后振荡反应2.5h左右。为了得到更高的活化效率，其中环氧氯丙烷和NaOH的用量，NaOH的浓度，反应时间都可以根据具体实验做出调整。由于环氧氯丙烷为油相，而NaOH溶液为水相，为了促进两者反应的进行，通常在混合物中加入助溶剂二甲基亚砜（DMSO）。亲和色谱-间隔臂的作用当配基分子量较小时，为了排除空间位阻作用，需要在配基和载体之间连接一个“间隔臂”间隔臂的长度有一定限制，超过一定长度后，配基与目标分子的亲和力会减弱亲和色谱-影响亲和吸附的因素杂质的影响料液中目标产物浓度

6、很低，杂质很多，少量杂质的非特异性吸附，会大大降低纯化效果杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化方法等众多因素相关料液流速流速的增大，分离速度加快，但柱效降低亲和色谱-目标产物的特异性洗脱特异性洗脱利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。特异性洗脱条件温和，有利于保护目标产物的生物活性。另外，由于仅特异性洗脱目标产物，对于特异性较低的亲和体系或非特异性吸附较为严重的物系，特异性洗脱有利于提高目标产物的纯度。亲和色谱-目标产物的非特异性洗脱非特异性洗脱是提高洗脱液

7、的pH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是较多采用的洗脱方法。当亲和结合力很大，利用通常的方法不能洗脱被吸附的目标产物时，可利用脲或盐酸胍等变性溶液使目标产物发生结构变化，失去与配基的亲和结合作用。但这些变性剂容易使目标产物或固定化配基发生失活或不可逆变性，需慎重使用。亲和膜-定义亲和膜是利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。亲和膜-亲和膜的提出固定床亲和层析的缺陷以多糖凝胶为固定相，机械强度低，流速受限放大困难（放大采用径向放大）亲和膜思路提出“降低柱高、增大柱径以降低压降、提高流

8、速”亲和膜-亲和膜的原理亲和配基固定在膜孔表面，流体