实验亲和层析纯化IgG.ppt

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1、生物分离与纯化实验共34学时持续改进协作实验报告：1.信息栏填全，遗漏项：同组人员；2.结果计算：过程完整3.讨论分析不可缺项，内容丰满，见解细致。上次实验总结实验（三）血清中抗体纯化（16学时）配基特异性ProteinA许多IgGs的Fc片断ProteinG许多IgGs的Fc片断Antigen特异的抗体Anti-IgG特异免疫球蛋白抗体纯化配基类型族特异性专一特异性二、实验原理低pH下洗脱用rProteinASepharose™分离IgGColumn:HiTrap™ProteinAFF结合缓冲液:20mM磷酸钠,pH7.0洗脱缓冲液:

2、0.1M甘氨酸-HCl,pH3注意:为了保护抗体的活性，将洗脱组分收集于1MTris-HCl,pH7.5中二、实验原理二、实验原理蛋白A和蛋白G的结合特异性种属蛋白A蛋白G结合结合人IgA可变的-IgD--IgEIgG1++++++++IgG2++++++++IgG3-++++IgG4++++++++IgM*可变的-鸟类蛋黄IgY†--牛++++++狗+++山羊-++豚鼠IgG1++++++IgG2++++++仓鼠+++马++++++考拉-+骆驼-+种属蛋白A蛋白G结合结合恒河猴++++++++大鼠IgG1+++++IgG2a+++++

3、+++IgG2b++++++IgG3+++++IgM*可变的-猪++++++兔+++++++小鼠IgG1-+IgG2a-++++IgG2b-++IgG3+++绵羊+/-+++相对结合强度–弱或不结合三、实验材料——纯化试剂：磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠、异地酸二钠、枸橼酸、精氨酸、盐酸胍、氢氧化钠、95%乙醇；均为分析纯。容器：50ml烧杯/三角瓶/试管10个；15ml收集试管5个；100ml三角瓶5个；250ml烧杯5个填料：ProteinA层析柱：XK10或预充柱装柱体积：~2ml血清：~2ml滤器：0.45μm针头式滤器5个；SD

4、S-PAGE:缓冲液：平衡液：20mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH7.2；(1L)冲洗液：20mM磷酸二氢钠，0.5M氯化钠，10mMEDTA二钠，pH7.2；(1L)洗脱液：0.1MGlycine-HCl，pH3.5；(1L)清洗液：6mM氢氧化钠。(1L)稀释血清：取2ml血清，用平衡缓冲液稀释5倍，0.45um针头滤器过滤。标记为S.三、实验材料——纯化三、实验材料——SDS-PAGE试剂：1.2x样品缓冲液2.凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml，过滤。3.pH

5、8.9分离胶缓冲液：Tris36.3g，加1mol/LHCl48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。4.pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris5.98g，加1mol/LHCl48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。5.TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7.pH8.3Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍（减半配制

6、）。8.考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。三、实验试剂——浓度测定考马斯亮蓝G-250蛋白染色液(1)牛血清白蛋白标准液（100ug/ml）精确称取0.010g牛血清白蛋白，溶于约50ml蒸馏水，定容到100ml.(2)考马斯亮蓝G-250试剂取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入85%正磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，此试剂在常

7、温下可放1个月。四、实验步骤1.ProteinA纯化：1）装柱：固定好层析柱，柱保持垂直，夹上出入口止水夹，量取20ml蒸馏水加入柱内，在柱外做一体积为20ml的标记，然后打开止水夹赶去出口内气泡，最后在柱内保留0.5-1m的水。ProteinA填料中加入适量平衡缓冲液，小心搅起凝胶，尽量一次加入柱内，待上层有一水层后打开止水夹，再用20-40ml平衡缓冲液不断加入柱内洗脱，最后待胶床表面仅有1-2厘米液层时，旋紧止水夹。装好的胶柱应符合无气泡、无节痕、床面平正。2）上样：血清让胶床表面几乎不留液层，然后小心注入床面中央~2ml稀释血清

8、，待样液几乎全部进入胶床表面后，关止水夹，室温下样品与填料结合15min。实验步骤1.ProteinA纯化：3）冲洗：加2倍柱体积冲洗缓冲液，打开止水夹，控制流出速度为2ml/min，并用试管收集流出液(记