实验八 亲和层析分离纯化蛋白质(14)

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1、实验八亲和层析分离纯化目标蛋白实验目的掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋白的原理和实验方法（第一部分）掌握SDS-PAGE检测目标蛋白原理和方法（第二部分）第一部分GST亲和层析分离纯化目标蛋白一、实验原理亲和层析生物大分子与配体特异非共价可逆结合。酶-底物或底物类似物抗体-抗原激素-受体外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体核酸-互补核苷酸序列（Oligo-dT）亲和层析原理GST亲合层析谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱甘肽GSH特异结合）GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上，（Sepharose4B）GST融合目标蛋白葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合用还原型GSH洗

2、脱GST融合蛋白GSH-Sepharose4BGSH-Sepharose4B外源蛋白的表达和纯化二、实验步骤（一）目标蛋白诱导表达和菌体收集1．0.5mmol/LIPTG诱导大肠杆菌中的蛋白表达，28℃，200rpm培养3-6h。2．5000rpm离心5min，倒掉上清。3．沉淀加40ml水，5000rpm离心5min。（二）细胞破碎1．倒掉上清，加30mlPBS缓冲液悬浮菌体。2．破碎菌体，超声波2min，停止1min。（菌液始终保持在冰浴中）3．重复8-10遍，直至菌液清澈。（三）离心1．每个小组分取1-2ml细胞破碎液，12000rpm，离心5min。2．分取50uL上清液

3、，4℃保存。3．其余的上清液准备过GST柱子。（四）装GST柱子1．清洗和装好层析柱，封闭出口。2．加入2mLPBS。3．用滴管取0.5-1mlGST填料，加入柱子中。4．打开柱子出口，使PBS缓慢流出。注意：始终保持柱内的液面高于GST树脂。（五）纯化目的蛋白1．用5mlPBS缓冲液洗柱床，重复3遍。2．将混合蛋白质溶液加到柱子中。3．用5mlPBS缓冲液洗柱子，重复3遍。4．加入1ml洗脱液。5．用离心管收集洗脱液，每管收集0.2ml。6．PBS缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。7．用分光光度计测定每一管的吸光度值，记录读数，绘制洗脱曲线。8．将读数最大的一管用于SDS-PAGE分

4、析。第二部分SDS-PAGE检测目标蛋白一、实验原理蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了蛋白质间原有的电荷差异。蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在15-200KD之间，迁移率和分子量的对数呈线性关系：logMW=K-bm浓缩胶浓缩胶pH6.8，GlypI6.0，三类离子在电场中的迁移速度：Cl->蛋白质>Gly-。电泳时，Cl-快，Gly-慢，在快慢离子间形成了一个低离子浓度的高压区，区内的蛋白质加速移动。当蛋白质移到Cl-区时，高电压消失，蛋白质的移动速度减慢，在快慢离子间被浓缩。二、实验步骤1．洗净玻璃板，用蒸馏水冲洗干净后吹干，安装制胶器。2．根据下列配方制作

5、12%分离胶。12%分离胶试剂名称12%分离胶蒸馏水2.5ml30%丙烯酰胺（29:1）3.0ml1.5MTris-HCl（pH8.8）2.0ml10%SDS75ul四甲基乙二铵（TEMED）10ul10%过硫酸铵（AP）75ul总体积7.5ml按上表中所列顺序加试剂，加完AP后轻轻摇匀，迅速加入两块玻璃板间。在分离胶液面上缓慢滴加1mL蒸馏水，聚合15min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残余的水。试剂名称5.0%蒸馏水1.7ml30%丙烯酰胺（29:1）430ul1MTris-HCl（pH6.8）310ul10%SDS25ul四甲基乙二铵（TEM

6、ED）10ul10%过硫酸铵（AP）25ul总体积2.5ml3．制作5.0%浓缩胶按照下表配好浓缩胶，轻轻混匀，灌胶2ml，插入梳子，聚合15min。4．把胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，拔掉梳子，电极缓冲液应该完全没过电极。5．每个点样孔加30ul样品，每板胶加10ulMarker。6．50V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到80V，电泳2-3h。7．等到溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。8．撬开玻璃板，将凝胶放在塑料盒内，加入染色液，染色30min。9．染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，用脱色液脱色。（或用蒸馏水加热脱色）pGEX-4T-3纤维素酶的纯化非诱导诱导纯化1纯

7、化2Marker100KD75KD50KD32KD25KD15KD37℃，OD=0.8，0.5mmol/L，IPTG，28℃，200rpm，6hSDS-PAGE样品制备1号样，过亲和层析柱前的蛋白质溶液25uL，加5uL5X上样缓冲液。2号样，分离纯化后的蛋白质溶液25uL，加5uL5X上样缓冲液3号样，蛋白质分子量标准，老师准备。标准蛋白质分子量（marker）兔磷酸化酶B97400牛血清白蛋白66200兔肌动蛋白43000牛碳酸酐酶31000胰蛋白酶抑制剂20100鸡蛋清溶菌