亲和层析法纯化胰蛋白酶.ppt

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1、亲和层析法纯化胰蛋白酶第一部分实验内容简介1内容摘要亲和层析包括了一整套复杂的底物及其配体与生物大分子之间相互作用时所形成的独特的生物学特性。在亲和结合的过程中涉及到疏水力、静电力、范德华力及空间阻力等因素的影响。亲和层析的概念可以理解为配基以共价键的形式与水不溶性固体载体共价结合，形成具有高度专一性的亲和吸附剂。以该介质为填料填充亲和层析柱，从复杂的混合物中有针对性分离某一种成分。本实验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目的，从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高的胰蛋白酶。围绕亲和层析实验所涉及的蛋白质和酶基本性质及相关技术进行综合训练。其中主要包括亲和层析介质

2、配基的制备，亲和介质的合成，蛋白质和酶的分离纯化，酶活性的测定等内容。通过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备的基本原理和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键环节，对实验中出现的问题进行科学的分析。使学生在学习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。2实验目的方法掌握蛋白质分离纯化的基本原理与操作技术掌握亲和层析的基本原理及亲和介质合成技术掌握胰蛋白酶活性及抑制活性测定的原理和方法掌握消光系数法测定蛋白质的原理及计算方法1.3实验流程鸡蛋清Spharose4B猪胰脏↓↓↓提取↓活化提取分离纯化↓↓↓纯卵粘蛋白(CHOM)→←活化Spharose4B胰蛋白酶原粗提

3、液↓↓偶联激活↓↓CHOM-Spharose4B→←胰蛋白酶提取液↓亲和层析↓酶促动力学←纯胰蛋白酶→酶活性测定↓酶蛋白含量测定1.4要求掌握的技术柱层析技术SephadexG-25分子筛层析DEAE-Cellulose离子交换层析CHOM–Sepharose4B亲和层析蛋白质提取技术10%TCA提取鸡卵粘蛋白3.5%乙酸,pH3.0提取胰蛋白酶原蛋白含量测定技术消光系数法测定胰蛋白酶含量消光系数法测定鸡卵粘蛋白含量生物活性测定胰蛋白酶比活性测定鸡卵粘蛋白抑制活性测定亲和介质合成技术载体-Sepharose4B的前处理载体-Sepharose4B的活化活化载体-Sepharos

4、e4B的偶联第二部分实验方法实验一鸡卵粘蛋白的分离纯化1鸡卵粘蛋白的基本性质1.1鸡卵粘蛋白的组成分子量:28000Da分子组成:四个分子量相近的亚基组成糖蛋白糖基部分:D-甘露糖,D-半乳糖,葡萄糖胺,唾液酸1.2化学稳定性耐热:在80℃条件下,理化性质不发生改变耐有机溶剂:在50%的丙酮溶液中,能保持良好的溶解度耐沉淀剂:在10%的TCA的溶液中不发生沉淀.1.3等电点性质等电点:pI在3.9-4.5之间溶液中的状态:在pH3.0的溶液中稳定,在pH8.0的溶液中容易分解鸡卵粘蛋白在10%的TCA不同pH值的溶液中的溶解状态见表1。表1，鸡卵粘蛋白在10%TCA溶液中的溶解

5、度溶液pH值鸡卵粘蛋白鸡卵清蛋白等于3.5沉淀5%溶解95%沉淀95%溶解5%低于3.5沉淀↑溶解↓沉淀↑溶解↓高于3.5沉淀↓溶解↑沉淀↓溶解↑1.2.鸡卵粘蛋白的提取2.1提取：每组发给50毫升的鸡卵清加入一定体积的10%pH1.15TCA溶液(轻轻搅拌一边搅拌一边加入),搅匀后用pH试纸检查pH值,待pH稳定在3.5±0.2后放置4℃冰箱过夜.2.2离心：转移50毫升离心杯中,于3000rpm离心15min。2.3过滤：倾出上清液，滤纸过滤，滤去上浮脂类物质和不溶物2.4调pH值：用1mol/LHCl将溶液精确调至pH3.5。量取体积。2.5丙酮沉淀：缓缓加入三倍体积预冷

6、的丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，放置冰箱内静止4小时。2.6离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到50ml离心杯中，于3000rpm离心15min。2.7除残留丙酮：弃去上清液，将盛有沉淀的离心杯至于真空干燥器中。抽去残留丙酮。（沉淀物的颜色由白变成透明胶状物即可）2.8溶解：加入25ml蒸馏水或20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液溶解，滤纸过滤，收集滤液，备用。3鸡卵粘蛋白的分离纯化3.1SephadexG-25柱脱盐(1)溶胀：称取15gSephadexG-25放入500ml的烧杯中,加入200ml蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。(2)装柱：取一支30×

7、3cm的层析柱，将溶胀好的SephadexG-25装柱，自然沉降。(3)处理：用2倍柱床体积的0.5mol/LNaCl溶液洗柱，2倍体积的蒸馏水洗去残留的NaCl。(4)平衡：用20mmol/L，pH6.5磷酸缓冲液平衡，流速控制在1.0-1.5ml/min。紫外检测仪检测柱内平衡状态，直到仪器绘出稳定的基线。(5)上样：将柱内的缓冲液液面流至于胶面相切，取20ml鸡卵粘蛋白提取液上样，待样液液面流至于胶面相切，加入2-3ml缓冲液冲洗层析柱内壁，待溶液液面流至于胶面相切，然后加入缓冲液距胶