亲和层析法ppt课件.ppt

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1、第七章亲和层析一般用于纯化蛋白质和核酸等大分子物质的方法的主要依据是各种大分子物质之间理化特性的差异性。缺点：由于这种差异性较小，因此要得到一种纯度稍高的物质，常常需要繁琐的操作，经历较长的时间，但最终收得率却甚低。1967年Axen等用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法，并成功地制备了固定化酶。这种利用大分子物质具有的特异的生物学性质进行纯化的方法，于20世纪70年代就有了惊人的发展，并逐步得到了广泛的应用。这使酶类等大分子物质的纯化过程变得较简单、迅速和高效(见表7-1)。第一节基本原理M

2、-L-S复合物欲分离的大分子物质S与相对应的专一物质L(配体)以次级键结合（亲和力），能生成一种可解离的络合物L-S，其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形成M-L-S复合物。亲和吸附剂配体L以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M上，制成亲和吸附剂M-L，或者叫做固相载体。亲和层析法根据L-S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层析方法，称为亲和层析法(affinitychromatography)。亲和层析的原理(见图7-1)：每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中

3、，特异的底物(S’)才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E-S’)一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。层析分离过程：样品过柱时，样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上;无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰；然后，恰当地改变起始缓冲液的pH值、或增加离子强度、或加入抑制剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第二个层析峰(见图7-2B)。如果样品液中

4、存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时，则采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。使用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。上面介绍的亲和层析法亦称：特异性配体亲和层析法配体,一般为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力；另有一种亲和层析法叫：通用性配体亲和层析法配体,则一般为简单的小分子物质(如金属、染料、以及氨基酸等)，它成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。特点：亲和层析的分辨率比

5、凝胶过滤层析高。用亲和层析法纯化样品时，操作步骤少，活力不易丧失。该法的缺点是：要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固相载体之后方可进行。第二节操作一、基质的选择理想的基质应满足下面的要求：1．极低的非特异吸附性；2．高度的亲水性。亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子物质接近。3．较好的理化稳定性。当配体固化和各种因素(如pH、离子强度、温度和变性剂等)变化时，基质很少甚至不受影响；4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合；5．适当的多孔性(即孔径大小和筛孔多少)。具体要求须根

6、据分离物的性质而定：当分离物与配体亲和力弱时，选用多孔性好的基质可提高结合容量；当分离物呈颗粒状或碎片状时，则选用多孔性差的基质对改善分离效果有利。一般亲和吸附剂采用的基质有：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔玻璃珠。相比之下，实践中应用较多的基质是：聚丙烯酰胺凝胶(Bio-300)、多孔性玻璃珠、琼脂糖珠(Sepharose4B)。三种基质中，目前应用最多的是：Sepharose4BSepharose由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖；它基本上能符

7、合理想基质的五点要求；同时Sepharose极易用溴化氰活化，并易于引入不同的基团；在温和的条件下，可以连接较多的配体，容易吸附大分子物质，且吸附容量也较大；此外，Sepharose4B的结构比Sepharose6B疏松，机械强度比Sepharose2B好。因此，Sepharose4B成了亲和层析中广泛使用的一种基质。二、配体的选择可选择的配体有：抑制剂、效应物、酶的辅助因子、类似底物、抗体[包括半抗原(碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸)-蛋白质复合物抗体]、其他物质(如外源凝集素、polyA、pol

8、yU、染料和金属离子)等。优良的配体须具备两个条件：1）与纯化的物质有较强亲和力一般来说，配体对大分子物质的亲和力越高(即Ki（抑制常数）或Ka（解离常数）较小)，在亲和层析中应用的价值就越大。2）具有与基质共价结合的基团该基团和基质结合后，对配体与互补蛋白的亲和力没有影响或影响不明显。就目前所知，可用作配体的种类很多，表7-2。三、亲和吸附剂的制备把配体偶联到基质上的方法有两类：物理的（如包埋法和吸附法等）化学的（如偶联法和交联法等）交联法：是用双功能试剂(如戊二醛、碳化二亚胺等