亲和层析法 (affinity chromatography)

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1、親和層析法（Affinitychromatography）   在這裡，我們從四個方向介紹親和層析法。 1.1.     基本原理：說明親和層析法運作的方式。2.2.     材質選擇：解釋如何選用適當的填充物。3.3.     樣品的分離：說明如何達到最佳的分離效果。4.4.     親和層析法的應用：使用親合層析法的時機。  一、基本原理 親和層析（affinitychromatography）也稱為功能層析（functionchromatography）、生物專一吸附（biospecificadsorption）或是選擇層析（selectivechromatography）

2、。所謂的親和力，乃生物大分子和其配體（ligand）之間形成可逆結合的能力，如酵素和它的受質（substrate）、抗體和抗原、激素和受體（receptor）、RNA和其互補的DNA等，親和層析就是根據這種親和力發展出來的純化方法，例如將酶的substrate接在固體支持物上，再用此支持物填裝管柱，當含有這種酶的樣品溶液通過管柱時，酶便被吸附在管柱上，其它的蛋白質及雜質不被吸附，全部從層析柱流出，最後使用適當的緩衝液，將欲分離的酶從柱中洗出來，經過這些步驟便能得到純化的酶。整個過程如下：      二、材質選擇 欲進行親和層析，ligand的選擇相當重要，ligand可以是輔酶、

3、酶的抑制劑或抗體，具備的條件如下： 1.1.     能與欲分離的物質進行專一性的結合，親和力愈大愈好。2.2.     Ligand與分子結合後，在一定的條件下又能解離，而且不會因解離破壞原本的生物活性。3.3.     Ligand上具有能連結到固體支持物上的團基，結合後不影響它與欲分離物質的結合專一性。 在實際操作上，若要純化的是某一種酶，則lignad選用此酶的競爭性抑制劑、受質（substrate）、輔酶或是效應劑（effector）；若是要純化酶的抑制劑，就選用此酶作為ligand；純化能與某維生素結合的蛋白質，可以使用這種維生素當ligand；純化激素的受體（rec

4、eptor），選用荷爾蒙當ligand。純化核酸可利用核酸與蛋白質的交互作用、DNA之間的互補關係、DNA與RNA的hybridization，運用適當的ligand。 親和層析中與ligand連接的支持物多為凝膠，凝膠應具備以下條件： 1.1.     不溶於水，但具有親水性，如此ligand才容易接近水溶液中的欲分離物。2.2.     化學惰性，沒有（或極少）離子交換這一類非專一性的結合。3.3.     具有足夠的化學團基，經活化後能與大量的ligand結合。4.4.     最好是均一的球狀顆粒，製成的管柱才能有較佳的流速。5.5.     具有多孔網狀結構，方便大分子

5、自由通過。6.6.     物理及化學性質穩定，不因洗出時改變的各種pH值、離子濃度、溫度或界面活性劑而改變其結構。  親和層析法使用的支持物種類，部份與膠體過濾法重覆，除了Polydextran、Polyacrylamide、Agarose以外，Ultrogel是能承受較大壓力的凝膠，流速高；cellulose主要用於親和免疫層析，但它有非專一性吸附的性質；Bio-glass是硼矽酸鈉經高溫和酸鹼處理製成的多孔玻璃，質地硬、強度高、孔徑均勻、不怕微生物侵襲，但缺點和cellulose一樣，它的表面對蛋白質也有非專一性吸附。  三、樣品的分離  要使欲分離的物質與ligand分離

6、，通常採用改變pH、離子濃度或緩衝液的組成，使其親和力降低，有時使用0.1M醋酸或0.1M氫氧化鈉沖洗，就能得到不錯的效果。如果純化對象與ligand的親和力不強，當連續通過大量的平衡緩衝液，就能在雜質洗出後，得到所要的物質；若親和力較強，則要使用較強的酸或鹼作為沖洗液，或是添加guanidinehydrochloride，但這些溶液容易使純化對象失去生物活性；用較高濃度的ligand溶液亦可將管柱上所吸附的物質洗出，此ligand可以與管柱上的相同或相異。 對於親和力小的物質，上柱的樣品最好是體積小而濃度高，黏度較大的溶液，可以將一定量的ligand加到待分離的溶液中，攪拌平衡

7、一段時間，進行過濾或離心，最後進行洗出的步驟。由於生物大分子和其ligand間達到反應平衡的速度很慢，樣品上柱的流速要儘量慢；通常親和力會隨溫度增高而降低，其中一例是將乳酸脫氫酶從管柱上的AMP洗下來時，所需的NADH濃度隨溫度增高而減少，在攝氏零度到十度間的變化尤其明顯，因此如果待分離的物質在攝氏4度可被緊密吸附，在攝氏25度以上容易被洗下來，則可在4度環境下進行親和吸附，在25度以上的環境進行洗出的步驟。  四、親和層析法的應用  1.1.     核酸的純化 因為DNA與R