亲和层析法分离凝集素-new

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1、亲和层析法分离亲和层析法分离青豌豆凝集素青豌豆凝集素原理原理亲和层析亲和层析是利用生物大分子的生物学特异性，是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子与其配体之间所具有的专一性亲和力即生物分子与其配体之间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。而设计的层析技术。例如，酶－酶的抑制剂，抗原－抗体，酶蛋白例如，酶－酶的抑制剂，抗原－抗体，酶蛋白－辅酶之间有－辅酶之间有专一专一的的可逆可逆的结合力（亲和力），的结合力（亲和力），在一定条件下能紧密结合成复合物，另一条件下在一定条件下能紧密结合成复合物，另一条件下又可解离。如果将复合物的某

2、一方固定在不溶性又可解离。如果将复合物的某一方固定在不溶性载体上，则可以从溶液中专一性地分离和提纯另载体上，则可以从溶液中专一性地分离和提纯另一方。一方。程序程序1.选择被分离蛋白质的配体（选择被分离蛋白质的配体（关键关键），将配体以），将配体以适当的形式连接到支持物上（如琼脂糖）。适当的形式连接到支持物上（如琼脂糖）。2.将支持物－配体络合物以适当的缓冲夜装在柱将支持物－配体络合物以适当的缓冲夜装在柱中。中。3.蛋白质混合物上到柱顶部。大多数蛋白质径直蛋白质混合物上到柱顶部。大多数蛋白质径直通过柱，能与配体相互作用的蛋白质被阻

3、留或通过柱，能与配体相互作用的蛋白质被阻留或被固定在柱上。被固定在柱上。4.洗柱，除去不需要的蛋白质。洗柱，除去不需要的蛋白质。5.用适当的方法将吸附在柱上的蛋白质洗下来。用适当的方法将吸附在柱上的蛋白质洗下来。亲和层析亲和层析的优点亲和层析的优点1.待分离物质与配基专一性结合，分辨率待分离物质与配基专一性结合，分辨率高，操作简单，通过一次性操作即可得到高，操作简单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质。较高纯度的分离物质。2.具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品，有的纯化

4、倍数达几千得到高浓度的样品，有的纯化倍数达几千倍。倍。3.利用生物学的特异性进行分离，因而分离利用生物学的特异性进行分离，因而分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质。的生物学性质。亲和层析的种类亲和层析的种类¢凝集素亲和层析凝集素亲和层析¢免疫亲和层析免疫亲和层析¢金属螯合层析金属螯合层析¢染料配体层析染料配体层析¢共价层析共价层析植物凝集素（植物凝集素（LectinLectin））¢一类特殊的蛋白，主要存在于植物中（豆一类特殊的蛋白，主要存在于植物中（豆科植物）；科植物）；¢对

5、糖有很高的亲和性，含有两个或多个糖对糖有很高的亲和性，含有两个或多个糖的结合位点；的结合位点；¢可以使许多细胞发生凝聚（程度取决于凝可以使许多细胞发生凝聚（程度取决于凝集素的浓度和细胞表面糖分子的多少之间集素的浓度和细胞表面糖分子的多少之间的比例）。的比例）。本实验的主要内容：本实验的主要内容：¢利用亲和层析法纯化青豌豆凝集素；利用亲和层析法纯化青豌豆凝集素；¢利用植物凝集素在体外能使红细胞发生凝利用植物凝集素在体外能使红细胞发生凝集的特性来鉴定纯化的凝集素。集的特性来鉴定纯化的凝集素。本实验中本实验中SephadexGSeph

6、adexG--5050的作用：的作用：1.1.载体载体2.2.配体配体葡萄糖的作用：葡萄糖的作用：¢与葡聚糖竞争结合凝集素，使凝集素被洗与葡聚糖竞争结合凝集素，使凝集素被洗脱下来脱下来操作步骤操作步骤破碎细胞离心↓4层纱布过滤↓离心上样↓↓硫铵沉淀洗脱↓↓离心透析↓↓溶解凝集实验↓装柱操作装柱操作柱中加入柱中加入1/41/4体积水，止水体积水，止水↓↓搅拌下将凝胶倒入柱中搅拌下将凝胶倒入柱中↓↓11--2cm2cm凝胶床时，打开柱出口凝胶床时，打开柱出口↓↓继续加凝胶至一定高度，停止加入凝胶，止水继续加凝胶至一定高度，停止加入凝

7、胶，止水↓↓沉降后加滤纸片沉降后加滤纸片↓↓平衡平衡凝集反应时红细胞中所加蛋白样品凝集反应时红细胞中所加蛋白样品::生理盐水生理盐水凝集素原液凝集素原液1:51:51:251:251:1251:1251:6251:625杂蛋白原液杂蛋白原液1:51:51:251:251:1251:1251:6251:625部分实验结果部分实验结果+凝集素凝集素--凝集素凝集素