凝集素亲和层析技术分离金花茶多糖的研究.pdf

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1、2014年第4期(总第153期)农业研究与应用(GenerMSefiMNo．153)No．4July2014AGRICULTURALRESEARCHANDAPPLICATION凝集素亲和层析技术分离金花茶多糖的研究路矗林华娟杨基住(，广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088；广西桂人堂金花茶产业集团股份有限公司)摘要：以蓖麻凝集素(RCA)为亲和配体制备亲和层析树脂，在比较2种固定载体制备亲和树脂对金花茶多糖分离效果的基础上，探讨了多糖上样量、NaC1浓度以及洗涤量对RCA．Sepharose一2B亲和树脂结合率或再生效果的影响，并采用高效液相色谱(HP

2、LC)对亲和多糖进行分离效果分析，为将亲和层析技术应用于金花茶活性多糖的分离纯化提供科学依据。研究结果显示．相比AF．Amino．650m树脂，RCA．Sepharose2B亲和树脂的分离效果比较好，而且可以进行反复使用多次。多糖上样量显著影响多糖与树脂的亲和效果，多糖结合率随上样量增加呈倒U型变化，当多糖上样量为l0．4mg／g亲和层析树脂时，其亲合率最高，达到57％左右；NaCI浓度对树脂的再生效果也有显著影响，用含0．2mol／LNaC1的磷酸缓冲液洗涤树脂可以有效恢复树脂对多糖的亲和效果。HPLC分析结果显示分离获得的亲和活性多糖是由3种不同分子量的多

3、糖组分组成。关键词：金花茶多糖蓖麻凝集素亲和层析分子量金花茶(Camelliachrysantha(Hu)Tuyama)化方法效率低、损失大，通过这些方法仅能获得少为山茶科、山茶属、金花茶组植物，常绿灌木或小量纯化多糖用于化学结构分析，不能满足其功能研乔木；仅分布于我国广西及越南北部。因其特有的究需求。因此有必要探索采用其他分离技术进行金金黄花色和生理活性功能，被称为“茶族皇后”、花茶多糖的分离纯化。在前期研究中，路矗等[】]探“植物界的大熊猫”。现代研究表明，金花茶具有讨了金花茶多糖与伴刀豆凝集素、蓖麻凝集素、欧卫抗氧化[1-53、抑制肿瘤生长N-s]、降血

4、脂[9-1o]等生理矛凝集素等的凝集反应特性，结果表明金花茶多糖与活性，其中多糖被认为是重要的生理活性成分之凝集素有明显的凝集反应特征，推测能与凝集素发一生凝集反应的多糖很可能就是活性多糖，但是与不，但其构效关系尚不清楚。动物试验研究结果显示，金花茶粗多糖具有明显的降血脂作用[1。田晓同凝集素其凝集反应强度有明显的差异，其中与蓖春等⋯]采用离子交换柱层析对金花茶多糖进行分离麻凝集素的凝集反应为最强。因此本研究尝试以蓖纯化得到TPS0、TPS1、TPS2、TPS3、TPS4、麻凝集素为亲和配体，制备亲和层析树脂，探讨将TPS56个组分，随后林华娟等[】]进一步采

5、用凝胶亲和层析技术应用于金花茶活性多糖的分离纯化，柱层析对TPS3组分进行分离纯化，又将其分为2为金花茶潘l生多糖的高效分离纯化提供理论依据。个多糖组分，并对其进行了化学结构特征分析。这1实验材料与仪器些研究结果表明，金花茶多糖组成相当复杂。由于所用的离子交换柱层析和凝胶柱层析等传统分离纯1．1实验原料基金项目：淀粉与植物蛋白深加工教育部工程研究中心开放课题(201101)。通讯作者：林华娟，女，副教授，博士，主要从事农产品综合利用以及食品质量安全控制方面的研究。收稿日期：2014一O5—132农业研究与应用金花茶叶片于2012年3月采摘于广西防城港温和搅拌1

6、h，抽滤，用超纯水，2mol／L的NaC1市十万大山金花茶基地，采摘后立即微波烘干，送溶液，超纯水，0．1mol／L醋酸钠缓冲液(pH4．5)，至广西桂人堂金花茶股份有限公司实验室，粉碎分超纯水依次洗涤，最后用50mmol／L的磷酸缓冲液装，于一20℃下保存备用。(pH7．4)充分洗涤，即得到RCA—Amino亲和层析亲和层析基质AF．Amino．650m，TOSOH公树脂，加人防腐剂，冰箱内保存待用]。根据偶联司(日本)；亲和层析基质Sepharose．2B，上海莱前后凝集素(以蛋白质含量计)的变化计算偶联率。宝生物科技有限公司；蓖麻凝集素(RCA)，Vec

7、tor2．4RCA—Sepharose2B凝集素亲和层析树脂的制公司(美国)。备1．2实验仪器Sepharose．2B的活化[1]：取5mL的Sepharose．LC．20AT高效液相色谱仪，日本岛津公司；2B，放人砂芯漏斗中，用蒸馏水反复清洗3～5次，SugarKS一804分析色谱柱，昭和通商株式会社。将Sepharose一2B悬液与2mol／LNa2CO3溶液按体积比l：1的比例混成悬浮液，缓慢搅拌，再加速搅2实验方法拌，在通风橱中加5mL浓度约为1g／mL溴化氰的2．1一般化学测定方法乙腈溶液，用6mol／L的NaOH溶液调pH至10．5蛋白质含量的测定

8、采用考马斯亮蓝法进行[1。左右，稳定后