亲和层析技术要点

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1、亲和层析纯化技术要点6thGroup小组成员:徐鹏，蒋美玲，季成，滕嘉琳，金爽，任沛生物制药工艺上主要运用的几种色谱技术分配色谱吸附色谱离子交换色谱亲和色谱凝胶色谱色谱技术6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogoAffinityChromatography亲和层析技术概述1亲和层析基本过程2His-tag亲和层析常见问题3Tips46thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo亲和层析技术概述WhatisAffinityChromatography?亲和层析是利用生物体中多数大分子物质具有与

2、某些相应的分子专一性可逆结合的特性而建立的分离纯化技术其专一性是由分子有关作用基团（官能团）的化学结构与它们的空间排列决定的亲和层析技术是目前分离纯化药物蛋白等生物太分子最重要的方法之一6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogoBackground生物大分子自身的特殊性和复杂性：热稳定性差，对环境的pH值、有机溶剂、某些无机载体和金属离子很敏感。因此欲高效分离纯化存在于相当大体积的组织匀浆或发酵液中的极少量目标产物，同时又混有大量理化性质相仿的其它生物活性物质时，仅根据理化性质不同设计分离纯化工艺已远不能满足生物技术发展的需

3、要。这时就必须从生物亲和作用力的角度进行研究，而亲和技术正是在此背景下产生的。6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo聚苯乙烯载体连接上抗原，分离血液中相应的抗体用淀粉装柱来分离淀粉酶——第一次认识到亲和层析琼脂糖载体取代聚苯乙烯载体，使亲和层析得到高速发展，成为“第二大类”分离纯化手段，应用广泛，亲和对众多。亲和层析发展史1910195519676thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo基本概念亲和作用：生物物质具有识别特定物质并与该物质分子结合的能力，且可以区分结构与性质相似的其他分

4、子，这种特异性的相互作用称为亲和作用。配基:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。配体：与配基是相对的概念。6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo配基应具备的特性：1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性2.必须具备能被修饰的功能基团常见配基-配体物质对：酶-底物酶-抑制物激素-受体抗原-抗体金属离子-氨基酸残基cDNA-对应的基因片段，等6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo亲和层析的特点亲和层析通用性差，洗脱不缓和高度特异性高效能操作简便快速亲和力缓和应用

5、广泛6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo亲和层析基本过程配基固定化(Immobilise)基质Matrix(载体):亲和层析中与配基共价结合,使其固相化的物质。6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo吸附(Adsorption)洗脱(Elution)6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo洗脱elution洗涤wash上样Sampleapplic.平衡equilibration6thGroupwww.themegallery.comCom

6、panyLogo6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo洗脱方法非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度、介电常数或温度使物质构象改变，浓缩、洗脱后立即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢复到天然结构特异性洗脱：再次利用生物学特异性只洗脱和配基专一作用的蛋白质，不洗脱由于非专一吸附上去的杂蛋白6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo亲和层析的基本类型生物亲和层析免疫亲和层析金属离子螯合亲和层析染料亲和层析拟生物

7、亲和层析6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo金属离子螯合亲和层析金属离子螯合亲和层析是利用金属离子的络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。NiSepharose6FastFlow含His-tag的rhEGF：His的咪唑基可以与Ni2+特异性结合。6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo常见问题1纯化的组分中没有His标签的蛋白?23样品黏度太大？层析柱堵塞？6thGroupwww.themegal

8、lery.comCompanyLogo