第七章 亲和层析技术

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1、第2章亲和层析1亲和分离技术概论利用生物分子之间的专一性识别性或特定的相互作用的分离技术称为亲和分离技术。在该技术中，亲和分离过程是通过引入亲和配基得以实现的（如图2-1）。所谓亲和配基，是指具有对生物分子专一识别性或特异相互作用的物质。将亲和配基固定在不同的介质上，可得到不同的亲合分离技术，如固定在层析介质上，达到专一性层析分离的技术称为亲和层析技术。将亲和配基接在分离膜上，得到亲和膜分离技术。图2-1：亲和分离过程的示意图生物分子之间的亲和识别包括抗体和抗原、酶和底物、激素和受体等之间的亲合作用，这些亲和作用属于生物专一性识别；此外，某些物质和生物大分子

2、之间还有一些特异性作用，如染料和某些酶（特别是脱氢酶和激酶等），植物凝集素和糖蛋白，金属离子和蛋白质表面的组氨酸等之间的作用，都可以应用于亲和分离过程。根据以上两种亲和作用的不同，可将亲和配基按其来源分为二类：生物特异性配基，如抗体、NAD、AMP等和拟生物亲和配基，如染料、金属离子等。表2-1常见亲和层析的命名作用原理以及它们的相关应用名称作用原理应用免疫亲和层析抗体和抗原专一性识别抗体或抗原固定化金属亲和层析Zn2+,Ni2+等与蛋白质表面组氨酸的特异性识别含有组氨酸的蛋白质染料亲和层析染料和蛋白质之间的特异性识别激酶、脱氢酶核苷酸亲和层析核苷酸和蛋白质

3、之间的特异性识别激酶、脱氢酶凝集素(Lectin)亲和层析凝集素和糖之间专一性的可逆的结合糖蛋白蛋白质A(ProteinA)亲和层析对IgG类似的抗体的专一性免疫蛋白等在亲和技术中应用的配基必须具备以下的条件：(1)亲和配基和被分离生物大分子之间的专一性识别或特异性作用，必须是可逆的。(2)配基与被分离的生物大分子之间要有足够高的结合常数，能形成稳定的复合物；但同时结合又不能太强，当外界条件适当的改变，且不使待分离的目的大分子变性时，就可将复合分子解离，使目标分子和配基分离，同时亲和配基得以再生。(3)能够进行一定的化学改性，易于固定在层析介质或其他分离介质

4、上。且固定到分离介质上之后，配基的专一性识别或特异性作用不发生明显的变化。目前，亲和分离技术众多，命名方法也很多。一般而言，常根据配基的名称和所使用技术的名称组合来命名，如固定化金属离子亲和膜技术、染料亲和层析等。现将常用的亲和层析技术名称、原理和应用简单的列如表2-1：1.1亲和配基在亲和分离技术中，亲和配基起着举足轻重的作用。亲和配基的专一性和特异性，决定着分离纯化时所得产品的纯度，亲和配基与目标分子之间作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度，影响它们的使用范围。根据配基亲和作用专一性程度和配基分子量的大小，可以将它们做如下分类：(1)单专一性的小分子配基

5、。如激素、维生素和某些酶抑制、金属离子等小分子，这些亲和配基只和某个或少数几个特定的蛋白作用，无论这些蛋白来源于特定细胞或生物体。单专一性的亲和配基专一性高，结合力较强，比较难于洗脱。(2)基团专一性小分子亲和配基。主要包括酶的辅因子，如NAD和其类似物，惰性染料等。如果被分离的酶需要辅因子，该蛋白就能够和辅因子结合（如果配基是辅因子类似物，原理也一样，只是酶可将其识别为辅因子）。将该辅因子或类似物作为亲和配基，便可将蛋白质结合到亲和配基上，实现分离纯化的过程。表2-2列出了一些基团专一性小分子亲和配基和它们对应能纯化的蛋白质。表2-2小分子亲和配基和对应所

6、分离的产品配基蛋白5’-ATPNAD＋－类脱氢酶2’,5’-ADPNADP＋－依赖脱氢酶NAD+NAD＋依赖脱氢酶CibacronBlue激酶或脱氢酶ProcionRedHE-3B脱氢酶或干扰素等其中蓝染料CibacronBlue是NAD辅因子的类似物，因而可用于提取需要NAD＋或NADP＋的蛋白质酶类。(3)专一性的大分子亲和配基。利用生物大分子具有三维识别结构的亲和作用，将其中的一种作为配基，就可以用来分离另外所对应的生物大分子，如凝集素ConA对多糖和糖蛋白有专一性；蛋白A及G对IgG和IgM等免疫蛋白有专一性。组织纤维溶酶原激活剂（t-PA）是一种糖

7、蛋白，具有激活溶酶原，促进血纤维蛋白溶解的作用。该蛋白质可以用纤维蛋白作为亲和配基进行分离。表2-3给出了几种常见的亲和配基和对应的分离产品。表2-3大分子亲和配基和所对应分离的产品英文名称中文名称应用Heparin肝素如抗凝血酶Lectin凝集素（如伴刀豆素A，大豆凝集素，麦胚凝集素等）如糖蛋白等ProteinA.G蛋白质A.G如IgG和IgM(4)免疫亲和配基。利用抗体和抗原之间的专一作用性进行的亲和分离技术，又称免疫吸附(Immunosorbent)，在免疫吸附中使用的亲和配基称为免役亲和配基。该配基即可以是抗原，也可以是抗体。现代杂交瘤技术已经有可能

8、大规模生产单克隆抗体，这为免疫亲和配基的生产和免疫亲