第五章 亲和层析分离技术ppt课件.ppt

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1、第五章亲和层析分离技术5.1概述5.2亲和层析基本原理及理论基础5.3亲和层析的操作过程5.4亲和层析的应用5.1概述亲和层析：利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。历史1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的实例。但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。20世纪60年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层析技术得到了快速的发展。用于蛋白质、酶等生物大分子的分离。5.2亲和层析基本原理及理论基础亲和层析的基本原理亲和层

2、析的特点亲和层析的类型亲和层析载体亲和配基一、亲和层析的基本原理基本原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。亲和力生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑制剂、激素－受体等等，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。配体Ligand:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。即被固定在基质上的分子称为配体。基质Matrix(载体):亲和层析中与配体共价结合,使其固相化的物质。亲和吸附剂：配体和基质是共价结合的，构成亲和

3、层析的固定相，称为亲和吸附剂。优点：1.纯化过程简单、迅速2.分离效率高3.对设备要求不高4.实验条件温和缺点：1.亲和吸附剂通用性较差2.洗脱条件较苛刻二、亲和层析的特点三、亲和层析的类型生物亲和层析免疫亲和层析固定化金属离子亲和层析拟生物亲和层析1.生物亲和层析利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和层析。通常具有高的选择性。典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素-受体等。2.免疫亲和层析免疫亲和层析是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。例如1：将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。例如2：在蛋白

4、质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低，用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。3.固定化金属离子亲和层析1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯合亲和层析的概念，首次成功地在琼脂糖上偶联了螯合剂亚氨基二乙酸(IDA)钠。IDA的钠盐与金属离子螯合后，可与生物分子如蛋白质结合，不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从而将蛋白质分离。固定金属离子亲和吸附剂（IMA）由载体，螯合基和金属离子三部分组成，利用

5、材料上固定的金属离子与蛋白表面的组氨酸等残基配位结合成络合物或螯合物，从而选择性的吸附蛋白质。目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合，这是IMAC用于蛋白质分离纯化的根据。金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巯基结合。含有不同数量的这些基团的蛋白质可以通过金属离子亲和层析得到分离。4.拟生物亲和层析定义：是利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位。以人工合成的配体为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析，例如染料亲和层析（DAFC）和氨基酸亲和层析(A

6、ALA)。染料配体，例如三嗪或三苯甲烷化合物，能通过共价键牢固地结合到亲和载体上。染料配体与很多蛋白以及酶的活性位点相互作用，以模仿这些生物分子的底物、辅助因子或结合剂的形式进行。四、亲和层析载体载体在亲和层析中的作用：使配体固定化；提供了亲和对两物质特异性结合的空间环境。（一）亲和层析对载体（基质）的要求必须能够充分功能化，以便于配基进行共价连接之用；有较好的理化稳定性和生物惰性，尽量减少非专一性吸附；有高度的水不溶性和亲水性，保证被吸附生物分子稳定性；具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过。（二）常用载体纤维素琼脂糖凝胶√聚丙烯酰胺凝胶√葡聚

7、糖凝胶多孔玻璃珠√1.纤维素纤维素是自然界中数量最大的大分子生物材料，取材十分方便。但由于纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。活化后因带有电荷，非特异性吸附力较强，加上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。目前主要用于分离与核酸有关的物质，如用寡聚脱氧胸腺核苷酸纤维素作固定相分离细胞提取液中的mRNA。2.琼脂糖凝胶是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相互结合的链状多糖，用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。琼脂糖凝胶载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。例如，Sepharose4B的分子量排阻极限达上百万，

8、便于大分子通过；载体几乎