《亲和层析》PPT课件

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1、第七章亲和层析Affinitychromatography8/5/20211技术背景各种大分子物质之间理化特性的差异性。但如果这种差异性较小，纯化较麻烦，最终收得率很低。8/5/20212内容提要第一节基本原理第二节操作第三节提高吸附剂的操作容量第四节应用实例8/5/20213第一节基本原理蛋白质2与配体无生物学特异性12LMS8/5/20214一、亲和层析的概念亲和力根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特征，将生物分子间的这种结合能力称为亲和力。8/5/20215亲和层析法利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性

2、吸附而进行选择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。8/5/20216亲和层析法的实质是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定相,配体高选择地吸附与其有生物特性的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。8/5/202178/5/202188/5/202198/5/202110■二、亲和层析法的作用机理固相载体(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB亲和基团配体XBAA8/5/2021118/5/2021

3、12特异性配体亲和层析法和通用性配体亲和层析法：方法配体性能特异性配体亲和层析法复杂的生命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物等）具有较强的吸附选择性和较大的结合力通用性配体亲和层析法简单的小分子物质（如金属、染料、以及氨基酸等）成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率8/5/202113三、亲和层析具备的三要素介质(基质)—具有活化基团间隔臂—连接介质与配体的分子配体—具有识别能力反配体（分离物）—与配体进行可逆结合8/5/202114■四、亲和层析法的四要点(2)SpecificBindingSubstanc

4、e(S)溶解Elution(4)配体Ligand(L)偶合反应(3)CouplingReaction杂质SSSS(1)SolidMatrixS8/5/202115五、亲和层析的特点条件温和：不影响样品的生物活性，适合生物大分子的操作。纯化效率高：一步法分离和纯化混合物中的样品，提纯达几千倍,得到高纯度样品。选择性强：依据生物学特异性，而非物理化学性质分离原理。故特异的层析图为2个峰，第1个为杂峰，第2峰为纯品。8/5/202116Activity■典型的亲和层析操作：ElutionvolumeProteinpH2.05*8/5/202117五、

5、亲和层析的特点柱层析柱小Vt＝1～1.5ml。上样量大,达1/2Vt体积并对样品的浓度与纯度要求不高。操作简单，时间快速。柱子填充载体昂贵，配体的特异性，有时找不到适宜的配体，不适合所有生物大分子样品。PriboFast®黄曲霉毒素B1免疫层析亲和柱8/5/202118内容提要第一节基本原理第二节操作第三节提高吸附剂的操作容量第四节应用实例8/5/202119二、配基（配体）的选择第二节操作一、理想基质的性质优良的配体必须具备两个条件：配体与生物大分子具有合适的亲和力；配体具有与载体牢固地结合，又不影响与生物大分子之间的亲和力。8/5/2021

6、20常用配体分离对象酶蛋白基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等抗体抗原、病毒、细胞外源凝集素多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白核酸互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合蛋白激素及维生素受体、载体蛋白细胞细胞表面特异性蛋白、外源凝集素专一性结合的生物体系8/5/202121配体待纯化的蛋白质配体待纯化的蛋白质抗原特定单克隆抗体或多克隆抗体肝素凝聚因子、脂酶、结缔组织蛋白酶、DNA聚合酶单克隆抗体特定抗原胆固醇胆固醇受体、胆固醇结合蛋白蛋白质A/蛋白质G免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸结合蛋白、白蛋白蛋白酶抑制剂蛋白酶核苷酸核苷酸结合蛋白、需核苷酸的酶磷

7、酸磷酸酶苯基硼酸盐糖蛋白三嗪染料脱氢酶、激酶、聚合酶、限制酶、干扰素凝集素糖蛋白抗生物素蛋白含生物素的酶糖凝集素、糖苷酶蛋白质亲和层析中的合适配体8/5/202122三、亲和吸附剂的制备载体的活化（CNBr）配体的偶联结合能力的测定用溴化氰活化载体8/5/2021238/5/202124四、特异性吸附欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时，配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有关。复合物带8/5/202125样品

8、中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除了与它们之间的亲和力有密切关系外，还与样品的pH值和离子强度有关系。8/5/202126五、层析步骤样品制备结合步