免疫沉淀实验.ppt

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1、实验一免疫沉淀类反应辽宁医学院附属一院检验科王彩红免疫沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体在溶液或凝胶中接触形成肉眼可见的抗原抗体复合物沉淀称为免疫沉淀反应。沉淀反应环状沉淀反应絮状沉淀反应琼脂扩散试验单向扩散试验＋电泳技术火箭免疫电泳对流免疫电泳双向扩散试验一、双向免疫扩散试验指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇，在浓度比例适当处形成沉淀线。根据沉淀线的有无、形状和位置对抗原或抗体进行定性分析，也可用于抗体的半定量检测本次实验利用此原理进行抗体效价的测定实验原理ABC试剂与器材抗体：兔抗人全血清抗原：人血清10-15g/L琼脂（以生理盐水配制）载玻片、打孔器、微量进样器37℃水

2、浴箱制板取加热融化的盐水琼脂约4ml，均匀浇在水平放置的载玻片上，使成厚度约为1.5mm的琼脂板，待冷凝。打孔打梅花孔（如图），各孔间的距离为4-5mm。实验步骤1倍比稀释抗体（见下表）加样用微量加样器分别取抗原、抗体10ul加入各孔。中央孔加10ul抗原，周围6孔分别加不同稀释度的抗体。温育将玻片放在湿盒中，37℃温育24h，观察沉淀线。123456生理盐水2525252525抗人血清502525252525在抗原和抗体孔之间会看到白色的沉淀线，将出现白色沉淀线的抗体最高稀释孔作为该抗体的效价。结果判断应用检测未知抗原或抗体抗原性质分析抗体效价滴定抗原或抗体纯度鉴定玻片要清洁，边缘无破损。

3、浇制琼脂板时要均匀、无气泡。孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂，底部勿与载玻片脱离。加样时应尽量避免气泡或加到孔外，以保证结果的准确性。反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假阴性、不出现或不清楚。注意事项对流免疫电泳是将双向免疫扩散和电泳相结合的一种技术。在pH8.6的缓冲液中，抗原带负电荷，向正极移动；抗体在电渗作用下向负极移动。在两者相遇的最适比例处形成白色沉淀线。实验原理二、对流免疫电泳抗原：人全血清抗体：兔抗人全血清1％琼脂：0.05mol/LpH8.6的巴比妥缓冲液配制电泳槽、电泳仪、载玻片、水浴箱、打孔器、微量加样器试剂和器材制板取已经融化的1%琼脂约4ml，加到水平放置的载

4、玻片上，使成厚度约为1.5mm的琼脂板，待冷凝。打孔用打孔器打孔，孔径3mm，两孔间隔4-5mm。（如下图所示）实验步骤加样用微量加样器分别取10vl抗原、抗体，按图加样。+—AgAb人血清羊抗人血清生理盐水电泳将琼脂板置于电泳槽内（抗原端放阴极侧，抗体端放阳极侧），两端贴上用电泳液浸湿的纱布。通电，调整电压为4V/cm长或电流3-4mA/cm宽，电泳30min-1h。结果判断在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间是否有白色沉淀线出现。如果沉淀线不清晰，可将琼脂板放入湿盒于37℃保温数小时，可增强沉淀线的清晰度。注意事项加样时不要起气泡，勿溢出琼脂孔。抗原、抗体的量应相近，如抗原量

5、过多，可造成假阴性结果，须通过稀释抗原加以解决。电泳时电压不宜过高或过低，过高可能会将琼脂拉断；过低时沉淀线出现的时间会延长。Thankyou!