体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱分析富硒大米含硒蛋白组成.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第6期2013年6月ChineseJournalofAnalyticNChemistry882—8871)OI：10．3724／SP．J．1096．2013．20845体积排阻色谱·电感耦合等离子体质谱分析富硒大米含硒蛋白组成方勇杨文建马宁汤晓智陈曦胡秋辉(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，南京210046)摘要建立体积排阻色谱．电感耦合等离子体质谱(SEC—HPLC-ICP—MS)联用技术分析富硒大米含硒蛋白组成方法。通过水提、盐提、碱提和醇提方法提取，并用丙酮沉淀蛋白，硒的回收率

2、分别为9．6％，16．8％，482％和14．9％，纯化后的蛋白结合硒的量由大到小依次为碱溶谷蛋白>球蛋白>醇溶蛋白>清蛋白。蛋白液经SEC—HPLC．ICP．MS检测，通过蛋白色谱峰(A=280nln)和ICP—MS硒峰(se)对比分析，利用分子量标准曲线测定出4类蛋白中含硒蛋白的分子量。结果表明，富硒大米中清蛋白和醇溶蛋白并不是硒的主要存在蛋白。硒主要存在于>7kDa的碱溶谷蛋白和球蛋白，其中碱溶含硒蛋白主要组分F分子量为199．8kDa。关键词体积排阻色谱；高效液相色谱；电感耦合等离子体质谱；大米；含硒蛋白1引言稻米是世界上的主要粮食之一，全世界一半以上人口以大米为主

3、食。大米蛋白是谷类蛋白中的最佳蛋白，被公认为优质的食品蛋白。蛋白质在大米中含量一般为5％～8％，胚乳中蛋白可分为4类：谷蛋白(80％以上)，清蛋白(4％一9％)，球蛋白(1O％一11％)和醇溶谷蛋白(2％～4％)J。硒fSe)是人和动物的必需微量元素之一，在防癌、抗癌，预防和治疗心血管疾病、克山病和大骨节病等方面的重要作用已为世人所公认。近年来，硒的研究重点逐渐从总硒转移到有机硒的研究。其中，硒蛋白已成为研究热点之一u3J。国内外十分重视大米蛋白的研究和开发利用，而对于富硒大米蛋白的研究较少。Xu等发现富硒大米的水提物具有较好的抗氧化活性，并与硒的含量成剂量关系；Fang

4、等[51通过提取大米中4类蛋白，分析蛋白中硒的含量，发现硒主要存在于碱溶谷蛋白中。富硒大米中硒主要以硒代甲硫氨酸(SeMet)存在于蛋白链中【6】。为了认识富硒大米在体内体外所表现的活性机理，需要进一步明确富硒大米中含硒蛋白的具体组成。因此探讨富硒大米含硒蛋白组成，有利于进一步评价含硒蛋白的生物有效性及其功能研究。高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC—ICP．MS)联用技术在硒的形态分析上具有高分离效率、高灵敏度等优点，被广泛用于金属组学研究中“】。本研究通过水提、盐提、醇提和碱提方法提取富硒大米蛋白，建立SEC．HPLC—ICP—MS联用技术方法。以4类蛋白为研

5、究对象，分析富硒大米蛋白中含硒蛋白的组成情况。2实验部分2．1仪器、试剂与材料SorvallRC5B高速冷冻离心机(美国Dupont公司)；TurboVapLV氮吹仪(美国Zymark公司)；微波消解系统(美国CEM公司)；7500ce型ICP-MS(美国Agilent公司)，包括自动进样器(I-AS)、微型同心雾化器、ScoR双通道雾化室(2qc)、屏蔽炬管、7500ce透镜组和八极杆碰撞池反应系统；1100型高效液相色谱系统(美国Agilent公司)。牛球蛋白(158kDa)、鸡卵清蛋白(44kDa)、马肌红蛋白(17kDa)、细胞色素C(12．5kDa)、抑肽酶(6

6、．5kDa)、维生素B，(1．35kDa)、(Gly)(0．36kDa)和(Gly)，(0．189kDa)等分子量标样均购于美国Sigma．Aldrich公司。甲醇和乙腈(色谱纯)，HNO(优级纯，68％)；HCI(36％)、丙酮、正已烷、三羟甲基2O12_08之O收稿；2012一lO_o8接受本文系国家自然科学基金(No．31101247)、江苏省高校自然科学基金重点项目(No．10KJA550011)和江苏省自然科学基金(No．BK2011833)资助’E—mail：qiuhu~u@due．edu．ell第6期方勇等：体积排阻色谱一电感耦合等离子体质谱分析富硒大米含硒

7、蛋白组成883氨基甲烷(Tris)，均为分析纯(美国FisherScientific公司)。实验用水为超纯水(182MQcm)。富硒大米样品的制备参考文献[6]，分别取适量普通大米和富硒大米，50℃烘干，过80目筛，制备米粉样品，作为含硒蛋白提取与分析的原料。2．2实验方法2．2．1大米中4种蛋白的提取与纯化分别称取5g干燥后的脱脂大米，在室温条件下，分别用50mL水，5％NaC1，O．08mol／LNaOH和70％乙醇溶液，磁力搅拌提取3次后，以5000r／min离心10min，分别合并上清液。然后，分别在水溶蛋白液、盐溶蛋