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1、第36卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第2期2008年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry206～210高效液相色谱2等离子体质谱联用方法研究富硒大米中硒的形态1,2311112张涛高愈希李柏李玉锋陈春英吴刚1(中国科学院高能物理研究所核分析技术重点实验室,纳米生物效应与安全性实验室,北京100049)2(包头医学院基础医学部,包头014010)摘要根据Osborne溶解性蛋白质分类法,用去离子水、2%NaCl溶液、70%乙醇、015%KOH4种溶液分别提取出大米中相应的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白。利用电感耦合等离子质谱(ICP2MS)
2、测量各类蛋白提取液中的硒含量;用色谱与质谱联用法对大米蛋白提取液中含硒蛋白组分及含硒氨基酸组成进行初步分析。结果表明:大米中的硒主要与蛋白质结合,在4类蛋白提取液中硒含量由高到低的分布顺序为:谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白。清蛋白提取液中,分子量为1216kDa蛋白是主要的含硒蛋白组分;大米中约30%的硒以硒代半胱氨酸形式存在。关键词大米,硒,形态分析,高效液相色谱,电感耦合等离子质谱1引言硒是一种人体必需的微量元素,在体内充当多种含硒酶如谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心,发挥着抗氧化,保护细胞膜免受氧自由基氧化损伤的作用。此外还具有提高机体免疫力以及消除重金属积累和毒性等生理生化功能。人体缺
3、硒可以导致克山氏病、大骨节病等一系列疾病。补硒可以预防相关疾病的发生。目前市场上出现了许多富硒食品和保健品,如富硒米、富硒香菇、富硒螺旋藻、富硒酵母等。研究它们的硒含量及形态对其品质评价具有重要的意义。大米是人类的传统主食,其硒含量、形态与人体硒营养状况密切相关。大米中硒形态主要分为无机硒和有机硒两大类。无机硒包括硒酸(selenate)、亚硒酸(selenite);有机硒则包括硒代半胱氨酸(selenocys2tine)、硒代蛋氨酸(selenomethionine)等含硒小分子以及硒与碳、硫等原子相结合而形成的含硒生物大分[1][2]子。王军等采用电感耦合等离子体质谱(ICP2MS)方法
4、测定了鱼中痕量硒。杨容甫等用二氨基萘荧光分析法测定了用叶面喷硒法培养出的富硒米中的总硒、有机硒及硒代蛋氨酸的含量。证实该富硒米中绝大部分为有机硒,约占总硒含量的99%以上,主要以硒代蛋氨酸形式存在。本实验为了分析富硒米中的硒含量及形态,采取顺序搅拌离心法提取4类蛋白质,利用ICP2MS测量其中的硒含量;使用体积排阻色谱和电感耦合等离子质谱联用方法(SEC2UV2ICP2MS)初步分析大米蛋白提取液中含硒蛋白的分布;用反相离子对色谱结合电感耦合等离子质谱(RPLC2ICP2MS)分析与大米蛋白结合的含硒氨基酸的种类。2实验部分211仪器与试剂ThermoX7电感耦合等离子质谱仪(美国Therm
5、o公司);高效液相色谱仪(Waters公司);富硒大米(安徽天长良圆米业有限公司);胰蛋白酶(德国Serva公司);蛋白酶K、链霉蛋白酶(德国Merck公司);乙醇、HNO3、H2O2、H3PO4均为国产优级纯试剂;其余为国产分析纯试剂。样品处理及溶液配制全部使用经MilliQ纯净水机处理的去离子水。212大米蛋白质的提取和浓缩将大米粉碎、研磨,过01089mm孔径筛,贮存于干燥器中备用。用去离子水、2%NaCl溶液、70%乙醇、015%KOH溶液顺序提取相应蛋白,提取过程见图1。2007205205收稿;2007208206接受本文系国家自然科学基金(Nos.10475092、104901
6、80、20777075)和中国科学院方向性项目(No.KJCX3.SYW.N3)资助3E2mail:gaoyx@mail.ihep.ac.cn第2期张涛等:高效液相色谱2等离子体质谱联用方法研究富硒大米中硒的形态207在更换不同溶剂时,加入去离子水20mL搅拌10min,以3000r/min离心10min,吸去上层清液以去除残留的溶剂。同一种溶剂共提取5次。前3次溶剂体积为20mL,搅拌20min;后两次中每次加入溶剂体积减少为15mL,搅拌时间延长到30min。每步得到的[2]提取液用考马斯亮兰G2250染色法测定其中的蛋白含量。提取完毕后将同种蛋白提取液合并,其中清蛋白、球蛋白、谷蛋白提
7、取液进行冷冻干燥,所得的清蛋白、球蛋白、谷蛋白提取液冻干粉分别称重,干燥保存;醇溶蛋白提取液在室温通风条件下挥发溶剂,记录浓缩后醇溶蛋白体积。213蛋白提取液中硒含量的测定取一定量的蛋白提取液冻干粉、浓缩液及米粉,加入6倍体积的V(HNO3)∶V(30%H2O2)=4∶1混合溶液,170℃下密闭消化8h,而后控制温度在80℃,蒸发消化液至011～012mL,用2%HNO3定容至2mL,同时以去离子水做试剂空白
