体积排阻色谱_电感耦合等离子体质谱分析富硒大米含硒蛋白组成

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第6期2013年6月ChineseJournalofAnalyticalChemistry882～887DOI:10．3724/SP．J．1096．2013．20845体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱分析富硒大米含硒蛋白组成*方勇杨文建马宁汤晓智陈曦胡秋辉(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，南京210046)摘要建立体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱(SEC-HPLC-ICP-MS)联用技术分析富硒大米含硒蛋白组成方法。通过水提、盐提、碱提和醇提方法提取，并用丙酮沉淀蛋白，硒的回收率分别为9．6%，1

2、6．8%，48．2%和14．9%，纯化后的蛋白结合硒的量由大到小依次为碱溶谷蛋白＞球蛋白＞醇溶蛋白＞清蛋白。蛋78白液经SEC-HPLC-ICP-MS检测，通过蛋白色谱峰(λ=280nm)和ICP-MS硒峰(Se)对比分析，利用分子量标准曲线测定出4类蛋白中含硒蛋白的分子量。结果表明，富硒大米中清蛋白和醇溶蛋白并不是硒的主要存在蛋白。硒主要存在于＞7kDa的碱溶谷蛋白和球蛋白，其中碱溶含硒蛋白主要组分F1分子量为199．8kDa。关键词体积排阻色谱;高效液相色谱;电感耦合等离子体质谱;大米;含硒蛋白1引言稻米是世界上的主要粮食之一，全世界一半以上人口以大米为主食。大米蛋白是谷类蛋白中的最佳蛋

3、白，被公认为优质的食品蛋白。蛋白质在大米中含量一般为5%～8%，胚乳中蛋白可分为4类:谷［1］蛋白(80%以上)，清蛋白(4%～9%)，球蛋白(10%～11%)和醇溶谷蛋白(2%～4%)。硒(Se)是人和动物的必需微量元素之一，在防癌、抗癌，预防和治疗心血管疾病、克山病和大骨节［2］病等方面的重要作用已为世人所公认。近年来，硒的研究重点逐渐从总硒转移到有机硒的研究。其［3］中，硒蛋白已成为研究热点之一。国内外十分重视大米蛋白的研究和开发利用，而对于富硒大米蛋［4］白的研究较少。Xu等发现富硒大米的水提物具有较好的抗氧化活性，并与硒的含量成剂量关系;［5］Fang等通过提取大米中4类蛋白，分析

4、蛋白中硒的含量，发现硒主要存在于碱溶谷蛋白中。［6］富硒大米中硒主要以硒代甲硫氨酸(SeMet)存在于蛋白链中。为了认识富硒大米在体内体外所表现的活性机理，需要进一步明确富硒大米中含硒蛋白的具体组成。因此探讨富硒大米含硒蛋白组成，有利于进一步评价含硒蛋白的生物有效性及其功能研究。高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)联用技术在硒的形态分析上具有高分离效率、高灵敏度等优点，被广泛用于金属组学研［7～11］究中。本研究通过水提、盐提、醇提和碱提方法提取富硒大米蛋白，建立SEC-HPLC-ICP-MS联用技术方法。以4类蛋白为研究对象，分析富硒大米蛋白中含硒蛋白的组成情况。2

5、实验部分2．1仪器、试剂与材料SorvallRC-5B高速冷冻离心机(美国Dupont公司);TurboVapLV氮吹仪(美国Zymark公司);微波消解系统(美国CEM公司);7500ce型ICP-MS(美国Agilent公司)，包括自动进样器(I-AS)、微型同心雾化器、Scott双通道雾化室(2℃)、屏蔽炬管、7500ce透镜组和八极杆碰撞池反应系统;1100型高效液相色谱系统(美国Agilent公司)。牛γ球蛋白(158kDa)、鸡卵清蛋白(44kDa)、马肌红蛋白(17kDa)、细胞色素C(12．5kDa)、抑肽酶(6．5kDa)、维生素B12(1．35kDa)、(Gly)6(0．

6、36kDa)和(Gly)3(0．189kDa)等分子量标样均购于美国Sigma-Aldrich公司。甲醇和乙腈(色谱纯)，HNO3(优级纯，68%);HCl(36%)、丙酮、正已烷、三羟甲2012-08-20收稿;2012-10-08接受本文系国家自然科学基金(No．31101247)、江苏省高校自然科学基金重点项目(No．10KJA550011)和江苏省自然科学基金(No．BK2011833)资助*E-mail:qiuhuihu@njue．edu．cn第6期方勇等:体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱分析富硒大米含硒蛋白组成883基氨基甲烷(Tris)，均为分析纯(美国FisherScien

7、tific公司)。实验用水为超纯水(18．2MΩcm)。富硒大米样品的制备参考文献［6］，分别取适量普通大米和富硒大米，50℃烘干，过80目筛，制备米粉样品，作为含硒蛋白提取与分析的原料。2．2实验方法2．2．1大米中4种蛋白的提取与纯化分别称取5g干燥后的脱脂大米，在室温条件下，分别用50mL水，5%NaCl，0．08mol/LNaOH和70%乙醇溶液，磁力搅拌提取3次后，以5000r/min离心10min