遗传病的基因诊断.ppt

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1、遗传病的基因诊断药学2班辛鑫一、基因诊断的概念及常用技术基因诊断—利用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测基因的存在,分析基因的结构变异和表达状态，从而对疾病作出诊断。（一）基本概念（二）基因诊断常用方法核酸分子杂交PCRDNA序列测定DNA芯片技术1、核酸杂交基本原理-------核酸变性和复性理论即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在与其互补的同源核苷酸序列。probeprobe核酸杂交的关键要

2、素probeDNAtargetDNAsignaldetection核酸杂交方法分类按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。固相杂交分类Southern印记杂交Northern印记杂交斑点杂交原位杂交Southernblot是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行定量和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。Northern杂交用于RNA的检测，能对组织细胞中

3、总RNA或mRNA进行定性和定量分析。斑点杂交（Dotblot）可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。原位杂交（Colonyinsituhybridization）可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检出基因和基因产物的亚细胞定位。2、利用PCR及结合其他技术进行基因诊断直接采用PCR进行基因诊

4、断采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLPs）进行基因诊断采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）斑点杂交进行基因诊断通过PCR产物的反相点杂交(RBD)进行基因诊断采用PCR产物的单链构象多态性(SSCP)分析进行基因诊断采用PCR技术对靶核酸进行定量分析寡核苷酸杂交分析SNP和等位基因特异寡核苷酸杂交（ASO）3、DNA序列测定DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位，突变的性质。4、DNA芯片技术应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达

5、的情况进行分析。（三）基因诊断的特点高特异性高灵敏度获得稳定的结果早期快速适用性强，应用范围广二、遗传病的基因诊断（以血红蛋白病为例）（一）血红蛋白病概述血红蛋白由四条链组成，两条α链和两条β链，每一条链有一个包含一个铁原子的环状血红素。血红蛋白病（hemoglobinopathy）是由于血红蛋白分子结构异常（异常血红蛋白病），或珠蛋白肽链合成速率异常（珠蛋白生成障碍性贫血，又称海洋性贫血）所引起的一组遗传性血液病。临床可表现溶血性贫血、高铁血红蛋白血症或因血红蛋白氧亲和力增高或减低而引起组织缺氧或代偿性红细胞增多所致紫绀

6、。（二）血红蛋白病的分类异常血红蛋白病：Hb结构发生了变化导致贫血病如：镰刀状细胞贫血地中海贫血：组成Hb的珠蛋白很成降低或消失，Hb的结构不发生变化亦称：珠蛋白合成障碍性贫血（三）镰状细胞贫血红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫血。患者多在成年以前死亡×MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb1、镰状红细胞贫血分子机制567--ProGluGlu—--CCTGAGGAG--567--ProAlaGlu—--CCTGTGGAG--2.镰状细胞贫血的基因诊断方法常用方法有限制

7、性内切法（RE），ASO，ARMS，跨越断裂点的PCR技术（裂口-PCR）最常用的是RE限制性内切酶/Southernblot采集制备血液DNA→内切酶MstⅡ消化→电泳→转膜→32P标记的β珠蛋白cDNA杂交→放射自显影+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析PCR/限制性内切酶设计引物→PCR扩增→产物进行限制性内切酶酶切→电泳→EB染色→直接观察例：引物1：5’-GGGCTGGGCATAAAAGTCA-3’引物2：5’-AATAGACCAATAGGCAGAG-

8、3’扩增产物294bp引物1CCTGAGGAGCCTGTGGAG引物1引物2引物2294bp103bp191bpMstⅡ酶切位点(CCTNAGG)+﹣103bp191bp294bp正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者PCR产物的限制性酶切分析（四）、β－地中海贫血(β－Thalassaemia,简写β