基因诊断在遗传病检测中的应用

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1、基因诊断在遗传病监测中的应用目前发现人类遗传性疾病有3000多种，如果仅依靠以往的染色体分析技术或对基因产物与代谢物的测定，我们只能对其中为数极少的一部分疾病在发病前或产前进行诊断。因为许多基因的表达有时相性和组织特异性（如有些基因在胎儿早期并不表达、苯丙氨酸羟化酶只在肝组织中表达）。用常规的方法采集的胎儿标本或其他人体材料，常常不能测出这些基因的产物或代谢产物。然而，作为构成机体基本单位的细胞，无论其来自何种器官或组织，它们的基因组成却是完全一致的；虽然在某些特异化的组织细胞中某些基因并不表达，但那些基

2、因的突变却存在于一切细胞之中。如果采用基因分析的方法进行监测，在个体发育的任何阶段，以任何一种有核细胞为检材，基因的缺陷都能被监测出来。这就是近十几年来飞速发展的重组DNA技术给遗传病的早期（症状前和出生前）诊断带来的福音。重组DNA技术不仅极大地丰富了我们对人类遗传病分子病理学的知识，而且同时也提供了从DNA水平对遗传病进行基因诊断的手段。自从1978年发现第一个限制酶切位点多态性并应用于遗传病（镰形细胞贫血）的基因诊断以后，能够进行基因诊断的病种不断增加，方法和途径越来越多。一、基因突变的类型造成基因

3、突变的原因很多，有自发的也有外界理化因素的影响。从DNA序列改变的角度来看，不外乎单核苷酸的取代和DNA片段的插入或缺失两大类型。所产生的后果取决于突变发生的位置和性质，只要影响了基因表达过程中的任何一个环节，都会导致遗传性疾病。归纳起来如表1所示表1基因突变及效应一览表DNA序列的改变突变发生的部位mRNA水平的表现基因产物的改变举例1.大片段缺失或插入整个基因缺如缺如α地中海盆血基因片段异常功能缺陷DMD、BMD2.少数核苷酸的缺失或插入外显子与内含子接界拼接异常缺如3的整数倍外显子缩短或延长异常（氨

4、基酸缺失或插入）HbLeiden非3的整数倍外显子缩短或延长异常（移码突变）β地中海盆血3.单核苷酸取代启动子减少减少β地中海盆血剪接信号剪接异常缺如β地中海盆血PolyA信号不稳定减少β地中海盆血密码子中性突变正常密码子错义突变氨基酸取代异常血红蛋白密码子或内含子剪接异常缺如或移码突变β地中海盆血密码子无义突变肽链提前终止β地中海盆血终止密码肽链延长，量减少HbCanstantspring　起始密码　β地中海盆血缺如β地中海盆血二、遗传病基因诊断的途径在了解了基因突变的各种类型之后，对应用何种方法来诊断

5、它们便很容易理解了。例如某种遗传病是由于基因缺失造成的，可通过监测受检者是否缺失该基因来直接判断其基因型。如果某遗传病是核苷酸取代造成的点突变，便可以通过监测该突变的方法（ASO探针或酶切位点监测）来进行诊断。如果致病突变或病因还不清楚，但有相关的基因探针或已知其与某位点的RFLP紧密连锁，便可进行家系分析，通过该位点状态的连锁分析进行监测。下面根据不同的情况，举例说明基因诊断中常用的方法。1.直接监测（1）应用基因探针或PCR进行缺失型基因监测部分α地中海贫血和三分之二以上的杜氏及贝氏进行性肌营养不良（

6、DMD及BMD）是整个基因或基因片段的缺失造成的。应用基因探针（基因组DNA或cDNA探针）进行Southern印迹杂交，如果某些杂交片段消失或片段长度改变（不是由于限制酶识别位点的改变造成的RFLP），即可判定受检者有基因缺失。应用近年来发展起来的PCR技术，也可进行缺失基因的监测。根据缺失发生区域的DNA序列，合成一对引物进行基因扩增（反应体系中必须包含有另一无关DNA片段的扩增引物，作为反应是否成功的内对照），通过凝胶电泳检查，如果没有扩增片段，便说明该基因或该DNA片段缺失，对α地中海盆血中的Hb

7、Bart水肿胎儿的产前诊断和DMD/BMD的产前基因诊断都是应用此法进行。（2）造成特异限制酶切位点改变的突变基因的监测有时，某些“点”突变（一般为单个核苷酸的取代或少数几个核苷酸的缺失或插入）正好影响了某种限制酶的识别位点（丢失或增加），对这些与基因突变相关的酶切位点的改变，可用来进行突变基因的直接监测。例如β珠蛋白基因密码子6处有一MstⅡ的识别位点（CC↓TGAGG），而在HbS病人的β珠蛋白基因，因其密码子6由GAG（谷氨酸）突变为GTG（缬氨酸），破坏了MstⅡ的识别序列。使得正常的两个杂交片段

8、（1.15kb,0.2kb）消失，而出现一个异常的1.35kb(1.15+0.2=1.35)片段。许多实验室应用β-S基因的这个特异标志，直接用MstⅡ酶解β珠蛋白基因相应区域的PCR产物进行HbS病的产前基因诊断。（3）突变位点特异性监测——ASO探针斑点杂交绝大多数“点”突变不改变酶的识别位点，但经DNA序列分析明确基因的突变的细节之后，可人工合成针对突变位点的特异寡核苷酸（allelespecificoligonucle