刘敬忠 临检培训基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用-临检培训班

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1、基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用刘敬忠首都医科大学附属北京朝阳医院北京基因诊断实验室北京朝阳医院法医物证司法鉴定所中心法则复转录翻译DNARNA蛋白质蛋白制反转录糖蛋白脂蛋白酶类激素细胞因子基因重组技术基因探针技术基因重组药物基因诊断基因治疗PKU尿毒症（口服artificialcells)基因诊断运用基因探针，PCR技术等探测特定靶基因的存在与否，或是否有基因突变等缺陷，从而对疾病或病原体感染作出诊断叫基因诊断。基因型表型基临血生细影病因床清化菌像理诊学学学学学断诊诊诊诊诊诊断断断断断断基因诊断的特点灵敏度

2、高（早期）特异性强操作简便取材大多不受组织器官限制可进行早期诊断，症状前诊断及产前诊断检测细菌内病毒等微生物时不需培养聚合酶链反应PolymeraseChainReaction（PCR）KaryB.Mullis1984年问世,成为分子生物学和生命科学发展史上的里程碑1993荣获诺贝尔奖Mendocin128号公路附近一棵七叶树下的突发奇想专利官司之战:DuPont与Cetus对薄公堂PCR原理示意图PCR技术的应用一、在分子生物学研究中的应用二、遗传病的基因诊断和产前基因诊断：血友病、地中海贫血、DMD、PKU等

3、等三、细菌、支原体、衣原体、立克次体等四、病毒五、白血病、肿瘤六、骨髓移植、器官移植供体配型选择七、法医学八、动植物学九、古人类学、古生物学PCR原理示意图热变性：从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94℃下热变性4分钟，使之解为单链。退火：然后置反应混合物于55℃，使引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。并迅速加入2单位耐热的TaqDNA聚合酶，混匀、离心10秒钟。为防止在整个PCR

4、过程中，水份的蒸发影响PCR效果，通常加入35ul石蜡油封盖液面。引物延伸：置上述反应混合物于70℃水浴中1-2分钟，在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3’端A开始,沿着5’→3’的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。结果，DNA拷贝数增加了一倍。接着，将上述热变性—退火—引物延伸（称为一个循环）反复进行30-35次。只是热变性的时间缩短为1分钟左右。每经过一个循环，DNA拷贝数便增加一倍（×2）。因此，如进行n次循环，则拷贝数将增加2n倍！进行25个循环，则拷贝数将增加225倍

5、，即上百万倍。在琼脂糖凝胶电泳上可看到特异性长度的扩增带。可见PCR之所以高速扩增的关键是因为每次新合成的DNA链在后来的循环中都可以作模板，犹如滚雪球，数量迅速增加。如果引物5’端有几个与模板DNA不配对的碱基，仍可能与模板DNA退火、延伸，对PCR效果影响不大。这一特点，可使PCR产物两端带上限制酶的Linker，或造成DNA顺序的缺失、插入、碱基替代等。大大增大了PCR技术的应用范围。影响PCR效果的重要因素及注意事项：PCR技术的原理似乎非常简单明了，PCR反应的操作也并不复杂；但要取得好的结果和良好的可

6、重复性并非易事。必须彻底弄通其分子生物学的奥妙之处，并把握其各种影响因素，规范操作。以下列出影响PCR扩增效果的主要因素引物设计一定要科学合理，序列的特异性要高。长度一般在18-25个碱基，Tm值可按公式（G+C总数x4）+（A+T总数x2）（℃）估算。尽可能避开4个以上G或C等相同碱基串联重复。尽可能避免引物内部形成发夹结构或引物之间形成二聚体（Dimer）的可能性。G、C与A、T的比例尽可能1:1左右。同一反应管中的引物（甚至同一个Lab的所有引物）Tm值设计的相同。引物在反应体系中的浓度要经过优化。双重PC

7、R及多重PCR对各引物浓度间的比例要求更严。基因组DNA制备液纯度要好。其用量也并非越多越好。各种试剂小量分装保存，避免多次冻融。dNTP浓度要优化。退火温度参考Tm值进行优化。其对PCR的成败，非特异产物的出现与否关系最大。TaqDNA聚合酶的厂牌、批号和用量均要合适。对扩增难度较大的PCR，Mg2+浓度要适当增加。操作者的手法也有影响，要在实践中总结提高技术。荧光定量PCR行HLA-DrB1位点分型法的建立及与血清学方法的比较HLA分型技术HLA（人类白细胞抗原）MHC区基因（主要组织相容性复合物基因区）高度

8、多态性的基因区HLA分型技术一、淋巴细胞微量细胞毒试验1964年，PaulTerasaki,LA,USA二、DNA分型法优点：1.血样不要求新鲜;2.白血病患者WBC表面抗原被破坏,只能用DNA分型法;3.结果更准确可靠HLA分型技术DNA-RPLP,1982PCR/SSOPCR/反向斑点杂交PCR/SSCPPCR/SSPPCR/SBTR-Q-PCR/SSPPCR/dHP