基因扩增技术(pcr).

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1、PolymeraseChainReaction聚合酶链反应（PCR）Polymerasechainreaction又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，在模板DNA，引物（模板两端的已知序列）和四种脱氧核苷酸存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。PCR的定义PCR技术是由Cetus公司和加利福利亚大学1985年联合创造的，主要贡献者为KaryBmulis和HeneryA、Erlich。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，能检测每10万个细胞中仅含一个靶DNA分子的样品。因而发明人KaryB、mulis获1993年诺贝尔化学奖。1993年获诺贝尔化学奖

2、PCR的种类&RT-PCR&反向PCR&不对称PCR&多重PCR&巢式RT-PCR&实时定量荧光PCRPCR温度循环参数变性(denature)温度和时间模板DNA的变性：模板DNA双链在93-96加热2’-10’解离；经PCR扩增形成的双链DNA在93-96°C加热30”-1’。退火(anneal)温度和时间:Tm-5°C温度降至55C左右，特异引物与模板DNA单链配对结合。延伸(extend)温度和时间：72°C1000碱基/分钟在TagDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，引物为起始点，按碱基配对原理合成一条新的复制链。循环数在25~30个循环内，扩增的DNA量

3、增加明显，然后进入平台期。靶序列的初始浓度越低，所需循环数越高。PCR扩增效率（理论）以上三步为一个循环。每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，从理论上讲，每经过一循环，样本中的DNA量应该增加一倍，扩增DNA产量是以指数形式上升的，既n个循环后，产量为2n，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。PCR扩增效率（实际）实际上，PCR扩增效率比理论值要低。对于不同的基因来说，扩增效率也大不相同。(如图所示)经过一定循环数之后，PCR产物的量增长缓慢，进入所谓的“平台期”，在PCR扩增反应达到平台期前，模板扩增产物(N)与启始模板(N0)之间呈下列方程所示关系:N=N0(1

4、+E)n其中E是扩增效率，n是循环数。演示PCR反应的过程！PCR反应体系组成（1）DNA模板（2）引物（3）dNTP（4）耐热的DNA聚合酶（5）10×PCR缓冲液(含Mg++)模板核酸PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。RNA的扩增必须经逆转录成cDNA后才能进行正常的PCR循环，称为RT-PCR。PCR反应中模板加入量一般为102-105个拷贝的靶序列。人工合成的寡核苷酸-引物PCR扩增产物的特异性和扩增片段的大小是由引物限定的，因此，引物的设计对PCR的成功与否有决定性的意义。引物设计原则：软件+经验引物长度以15-30个碱基为宜；引物碱基尽可能随机分布，G+C含

5、量宜在45~55%左右；引物内部不应形成二级结构；两个引物之间不应形成二级结构；引物与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性；两个引物的Tm值要尽可能接近。一般PCR反应中引物的终浓度为0.1-1mol/L，在此范围内产物量基本相同。引物浓度低于0.1mol/L时，产物量降低；引物浓度过高会引导非特异产物扩增，还会增加引物二聚体的形成。引物浓度对PCR反应的影响合适的缓冲体系目前最常见的缓冲体系为10~50mmol/LTris-HCl(pH8.3-8.8,20℃)。Tris是一种双极性离子缓冲液，其主要作用是维持碱性的Taq酶作用环境。在缓冲液中加入明胶或无核酸酶的BSA，对酶有一定的

6、保护作用，Tween-20(0.05%-0.1%)及5mmol/L的二硫苏糖醇（DTT）也有类似作用。尤其在扩增长片段（延伸时间长）时，加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。Mg2+Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的。Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性、引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性以及引物二聚体的形成等等。因为，PCR反应混合物中的DNA模板、引物和dNTPs的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+的实际浓度。TaqDNA聚合酶需要的是游离的Mg2+，因此，PCR中的Mg2+的加入量要比dNTPs的浓度要高0.2-2.5mmol/L。最好对每种模板DN

7、A,每种引物都进行Mg2+浓度的优化。三磷酸脱氧核苷（dNTPs）四种三磷酸脱氧核苷（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，工作浓度应为20~200mmol/L。所用的四种dNTP的浓度应相等，以使错误掺入率降至最低。dNTPs浓度过低则反应速度下降，dNTPs浓度过高则扩增特异性降低，而且当dNTP浓度高于50mM时也会抑制TaqDNA聚合酶的活性。耐热DNA聚合酶Taq聚合酶是从耐热菌（thermus