[理学]pcr基因扩增

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1、PCR基因扩增一、实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术二、实验原理PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法，由美国人B.Mullis于1983年发明包括三个基本步骤:变性（Denature）：目的双链DNA片段在94℃下解链退火（Anneal）：两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对延伸（Extension）：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经

2、25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍1、PCR反应中的主要成份引物dNTPMg2+模板TaqDNA聚合酶反应缓冲液引物PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定引物设计和选择目的DNA序列区域时遵循下列原则：引物长度约为16～30bp引物中G+C含量通常为40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估计引物的解链温度四种碱基应随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对在引物内，尤其在3’端应不存在二级结构两引物之间尤其在3’端不

3、能互补，以防出现引物二聚体，减少产量引物5’端对扩增特异性影响不大，可引入酶切位点或突变位点引物不与模板结合位点以外的序列互补简并引物应选用简并程度低的密码子引物的浓度一般为0.1～0.5μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，引物浓度偏低则降低产量dNTPdNTP常用的浓度为20～200μmol/，而且4种dNTP的终浓度相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足而出现的错误掺入dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误掺入率，同时会抑制TaqDNA聚合酶的反应活性；适当的低浓度会提高反应的精确度注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间

4、的关系Mg2+Mg2+浓度会影响TaqDNA聚合酶的活性、真实性，影响引物退火、解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等通常Mg2+浓度范围为0.5～2mmol/L在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度模板PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，单链分子、双链分子、线状分子或环状分子均可以作为模板DNA（线状分子比环状分子的扩增效果稍好）模板的数量和纯度均会影响PCR结果：一般反应中的模板数量为102～105个拷贝。模板拷贝数过多可能会增加非特异性产物模板DNA

5、中的杂质也会影响PCR的效率TaqDNA聚合酶早期PCR扩增是由大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段完成，但这种酶不耐热，所以每一轮循环在变性和退火后必须加入新酶后来引入耐热的TaqDNA聚合酶，一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min，95℃40min，97℃5min，因此PCR中变性温度不宜超过95℃TaqDNA聚合酶的最适温度是72℃，连续保温30min仍具有相当的活性，一次加酶可满足PCR反应全过程的需要纯化的TaqDNA聚合酶有5’→3’外切酶活性，而无3’→5’外切酶活性，不具有Klenow酶的3’→5’校对活性，因此在PCR中有

6、错误掺入率，大约是每2×104个核苷酸中有一个，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤为注意TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。在100μL反应体系中，1.5～2U的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环使用TaqDNA聚合酶浓度过高，可引起非特异性产物的扩增，浓度过低则扩增产物量减少反应缓冲液一般含100mmol/LTris·Cl（20℃下pH8.3-8.8）,500mmol/LKCl和0.1％的明胶，有时候还有适当浓度的Mg2+Tris·Cl是一种双极性离子缓冲液，主要靠其调节pH，使TaqD

7、NA聚合酶的作用环境维持偏碱性KCl有利于引物的退火，但浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性明胶保护酶不变性失活Mg2+影响TaqDNA聚合酶的活性，直接影响反应的特异性和扩增DNA的产率反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇（DDT）或100μg/ml的牛血清白蛋白（BSA），它们可稳定酶活性2、PCR反应参数变性退火延伸循环次数变性变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的DNA双链会很快复性，减少DNA产量一般变性温度与时间为94℃1min。在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的

8、序列，可适当提高变性温度。但变性温度过