培养基血清浓度对人表皮干细胞增殖分化的影响.doc

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1、培养基血清浓度对人表皮干细胞增殖分化的影响南京大学医学院附属鼓楼医院李云剑林樋燕辛周宏初谭谦【摘要】H的:比较不同血清浓度培养体系对表皮干细胞增殖分化的影响。方法：采用两步舸消化法和IV銀胶原差速贴樂相结合的方法获得人原代表皮干细胞，分别以0%、5%、10%、15%和20%血清浓度的培养基在96孔板中进行培养。观察表皮干细胞形态，克隆形成及増殖的情况，应用四甲基偶氮畔蓝（MTT）比色法检测各组细胞存活和生长情况，分析量效和时效关系：持续传代培养细胞，每次传代的同时取适量细胞，用免疫细胞化学的方法进行表皮干细胞和表皮细胞相应标志物（K19、K14和K10）的测定。结果：

2、表皮干细胞在各种血淸浓度的培养基内均能形成克隆，增殖良好。用四甲基偶氮畔蓝（MTT）比色法测定，所得相同时间点各纽OD值在统计学上没有差异（P>0.05）,表皮干细胞生长速度各组间无差异。第1代表皮干细胞K19均有表达，而KI4和KI0表达均为阴性：其后高血清浓度（15%、20%）培养基中细胞较低血清浓度（0%、5%）先出现KI4、KI0蛋白的表达：培养至第10代是各组细胞均出现K10高表达，而K19、K14表达阴性。结论:在低血清浓度（0%、5%）的培养基中表皮干细胞生长良好，H能够相对较好保持表皮干细胞的特性。【关键词】表皮干细胞血清浓度增殖分化培养[Abstra

3、ct]ObjectiveTostudytheproliferationanddifferentiationofepidermalstemcellsinmediumwithdifferentlevelofserum.MethodstoobtaintheprimaryepidermalsteincellwithtwostepenzymedigestionmethodandtypeIVcollagencoatedchosenmethods.Culturethecellinmediumwithdifierenlserumlevel—0%、5%、10%、15%and20%.Th

4、eshapeandcloneformationandproliferationofthecellwasobservedthroughinvertedmicroscope,testedbytheMTTMETHODImmunocytochemistrywasusedtoobservetheexpressionofcorrespondingmarkersuchasKI9、KI4andK10onepidennalstemcellsineverygenerationafterpassaging.Resultstheepidermalstemcellcanformclonesin

5、eveiykindofseium-medium,withwellproliferation.TherewasnostatisticallysignificantdifferenceintheODvaluesbetweendifferenttimepointsusingMTTtest.TheexpressingoftheK19>K14>K10inlevelledscrum-mediumdidnothaveobviousdifferenceatfirst,buttherecandetectgradualdifterencebetweenthesesubgroupswith

6、difierenllevelofserumduringpassaging.Conclusiontheepidermalstemcellwillkeepitscharacteristicsandgrowbetterinmediumwithlowersenim.[Keyword]epidennalstemcellslevelofserumproliteralionanddifierentiationculture近年研究表明,表皮干细胞（epidermalstemcell,ESC）是皮肤发生、修复和重建的关键“种子细胞”。建立体外表皮干细胞的分离、纯化和培养体系，探讨ES

7、C增殖、分化和迁移等机制已成为皮肤创面修复领域的研究重点。其中，分离、诱导和调控ESC,是纽•织工程化皮月夬走向临床应用的核心技术。虽然农皮干细胞可以在体外培养扩增，但其在培养过程中极易分化，临床所需的表皮干细胞來源仍非常紧张。因此，如何在体外建立良好的培养体系，使得体外培养的表皮干细胞能够快速增殖而不分化或者延迟分化便成了目前急需解决的问题。本研究中，我们通过改变培养基血淸浓度，观测表皮干细胞的增殖分化现彖,得到相对满意的培养体系,为进一步研究表皮干细胞的分化、诱导等机制奠定了基础。1材料和方法1.1.1材料皮扶収自18〜25岁行包皮环切术患者，患