酿酒酵母和大肠杆菌的启动子特性及其代谢工程应用研究.pdf

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1、酿酒酵母和大肠杆菌的启动子特性及其代谢工程应用研究李哲2015年1月中图分类号：UDC分类号：酿酒酵母和大肠杆菌的启动子特性及其代谢工程应用研究作者姓名李哲学院名称生命学院指导教师李春教授答辩委员会主席陈国强教授申请学位工学博士学科专业化学工程与技术学位授予单位北京理工大学论文答辩日期2015年01月CharacterizationofPromotersfromSaccharomycescerevisiaeandEscherichiacoliandApplicationinMetobolicEngineeringCandidat

2、eName：ZheLiSchoolorDepartment:SchoolofLifeScienceFacultyMentor:Prof.ChunLiChair,ThesisCommittee：Prof.GuoqiangChenDegreeApplied:DoctorofEngineeringMajor：BiochemicalEngineeringDegreeby:BeijingInstituteofTechnologyTheDateofDefence：January,2015研究成果声明本人郑重声明：所提交的学位论文是我本人在指

3、导教师的指导下进行的研究工作获得的研究成果。尽我所知，文中除特别标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京理工大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的合作者对此研究工作所做的任何贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。特此申明。签名：日期：北京理工大学博士学位论文摘要代谢途径调控是代谢工程以及合成生物学的核心内容，可以在转录水平、翻译水平、蛋白质水平进行不同程度的调节。启动子作为代谢工程中最基本的功能元件是最为有效的在转录水平调节代谢途径的工具。本论文通过

4、对酿酒酵母及大肠杆菌的基因组进行分析，对组成型启动子进行了克隆和表征，同时将克隆得到的启动子应用于代谢工程的研究中，主要结果：（1）从酿酒酵母的糖酵解途径和氨酰tRNA合成酶途径中克隆得到了11个组成型启动子，利用eGFP和LacZ作为报告基因在转录和翻译水平上对启动子的强度进行了表征，结果表明克隆得到的启动子在强度上具有一定的多样性。不同途径的组成型启动子在酿酒酵母生长过程中强度会有不同的变化规律，同时利用半乳糖作为碳源时启动子的强度要比利用葡萄糖作为碳源时要强。（2）通过对糖酵解途径启动子的序列进行分析发现了转录因子结合位点

5、（TFBSs）对启动子功能的影响，并通过敲除实验验证了启动子FBA1p和GPM1p序列中Rap1、Gcr1及Gcr2的TFBSs对启动子的功能具有重要作用；同时将这2个启动子中相应的TFBSs与其他启动子进行融合后发现具有提高启动子强度的功能。在研究不同拷贝数的TFBSs以及不同来源的TFBSs的组合对启动子强度影响时发现不同的启动子对TFBSs的拷贝数及组合具有不同的饱和性和敏感性。（3）通过克隆木聚糖降解的关键基因木聚糖酶和木糖苷酶以及木糖醇转化基因木糖还原酶，利用前期克隆得到的启动子及合成生物学的方法，在酿酒酵母细胞内构建

6、了可以直接利用木聚糖转化木糖醇的代谢途径。通过对工程菌中的代谢途径进行转录水平的优化，将木糖醇的产量提高了90%。对酿酒酵母工程菌进行了发酵过程优化，确定了葡萄糖和半乳糖作为发酵过程中的辅助碳源，建立了两阶段补料发酵工艺，提高了木糖醇的产量，最终转化率达到71%。（4）从大肠杆菌的糖酵解途径中克隆得到了5个组成型启动子，利用eGFP作为报告基因在转录和翻译水平上对启动子的强度进行了表征，结果表明克隆得到的启动子在强度上具有一定的多样性，与常用的T7启动子相比较，最强的启动子GAPAp的强度为T7的8.92%。利用克隆得到的GAP

7、Ap和T7启动子构建了利用木糖转化木糖醇的大肠杆菌工程菌株BL-GAPAp和BL-T7。对工程菌进行了发酵条件优化，结果I北京理工大学博士学位论文表明BL-GAPAp的木糖醇转化率要远高于BL-T7，通过酶活测定及SDS-PAGE分析发现，BL-GAPAp中木糖还原酶主要以可溶性蛋白的形式存在，酶活较高；而BL-T7中木糖还原酶则主要是以包涵体的形式存在，酶活较低。关键词：启动子；转录因子结合位点；木聚糖；木糖醇；酿酒酵母；大肠杆菌II北京理工大学博士学位论文AbstractRegulationofmetabolicpathwa

8、yisthecoreofmetabolicengineeringandsyntheticbiology;itcanberegulatedattheleveloftranscription,translationandprotein.Thepromoteristh